PCR技术及其应用-2014.9

PCR技术及其应用张文举生命科学学院1这些事件有何联系？末代沙皇尼古拉二世1918年的流行性感冒病毒电影《侏罗纪公园》辛普森杀妻案曹操姓曹么？这些事件都运用到了PCR技术！2DNA是最重要的生物大分子之一DNA分子经过多个层次的包装DNA双螺旋3DNA及其复制半保留复制一系列因子帮助DNA的复制4复制叉5DNA聚合酶1）总是从5‘-3’端复制；2）DNA的复制需要一小段RNA作为“引物”5‘-3’端复制一段RNA作为“引物”6PCR技术的发明基因克隆的需要催生了PCR的发明1953年DNA双螺旋结构的发现1956年DNA聚合酶的发现1985年PCR的发明DNA聚合酶的分离“引物”的合成使极少量的DNA样本进行了大量的扩增！7多聚酶链反应技术（polymerasechainreaction，PCR）PCR技术的原理PCR技术的衍生技术实时荧光PCR技术PCR技术的应用81234522557294时间（min）温度（℃）PCR技术的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR反应过程PCR的特点PCR的操作步骤9PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃5’3’10PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物11PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶12PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束95℃第2轮开始13PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃TaqTaqTaqTaq14PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束15PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数

重复30轮后230=1,073,741,8241.8530=103,550,41716PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。17PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善但测序和引物合成的困难70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能所以，Khorana的设想被人们遗忘了……18PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）实现了在试管中模拟细胞内的DNA复制。然而，采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错19PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，特异性、真实性也较高，但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。

耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪20PCR技术的基本原理PCR反应过程PCR的特点PCR的操作步骤灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞细菌、病毒检测的灵敏度可达3个拷贝简便、快速一次性加好反应液，1～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体液、洗嗽液、毛发、活组织、细胞、石蜡包块、古生物标本等的粗提DNA21PCR技术的基本原理PCR反应过程PCR的特点PCR的操作步骤标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L22PCR技术的基本原理PCR反应过程PCR的特点PCR的操作步骤23设置反应程序(1)94℃变性5min，(2)94℃变性1min，(3)52℃退火1min，(4)72℃延伸1min。

(5)72℃延伸10min。重复(2)-(4)30次24PCR结果：1、对照(无模板)；2－6、PCR产物（5ul样品）PCR产物的电泳鉴定25（1）模板单、双链DNA均可，多种来源。质量要求不高，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般人基因组100ngDNA模板（100L）。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。（为什么？）PCR反应的影响因素

1)反应体系Lambda

DNA，模板量分别为100

pg,

10pg,

1pg,

100fg

,

10fg

26（2）引物引物是与待扩增DNA片断两翼互补的一段特异的寡核苷酸片断。引物是PCR反应中最关键的因素，因此引物序列的设计对于PCR是否成功是非常重要的。

271.引物长度：

以18-24bp为宜。（为什么？）2.碱基均衡分布：

四种碱基尽可能随机分布；G+C占40-60%，上下游引物应基本一致。3.避免形成二级结构：（为什么？）

发夹结构、二聚体。4.引物的两端：（为什么？）

3’端为关键碱基；5’端无严格限制。引物设计的原则：283’5’3’5’限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记295.引物的特异性：

引物序列应避免在模板内有较高相似性的系列，尤其是3’末端。可以在www.ncbi.nih/blast.cgi进行在线比较通过OMIGA、ClustalX等软件进行两两或多序列的比较。引物序列同源性比对：30引物设计引物设计常用软件主要有：PrimerPremier5.0Oligo6primer3ThePrimerGeneratorNetPrimer311.将序列输入软件中（2）在表中粘贴序列（1）新序列两个方法32选择序列文件所在位置（2）打开原有的序列文件33在对话框中输入待扩增序列点击左上角的“Primer”按钮342.设置相关参数353.得到的引物结果36Hairpin:引物自身是否会形成发夹结构Dimer:同一种引物是否会形成二聚体Falseprimiring:引物在待扩增序列中其他位置是否有配对CrossDimer:正向与反向引物间是否会形成二聚体正向和反向引物的互换正向和反向引物的评价正向和反向引物的信息每点击左边红色的按钮，就出现相应的内容对正向和反向引物进行编辑37可对引物进行增加或减少碱基用键盘输入5个碱基38引物的信息改动后引物的信息39重新回到双引物的界面40“Edit”－“Copy”－“SensePrimer”5'CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA3'4.输出引物序列41引物纯度：公司合成引物常用的纯化方式C18脱盐、OPC纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。普通PCR：OPC纯（>95%）较长引物（大于50个碱基）：PAGE纯（>95%）经过修饰或标记的引物：HPLC纯（>99%,但价格昂贵）引物浓度：0.1-0.5mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。（为什么？）42

合成内容产量(OD)发货时间(工作日)纯化方式价格(￥)普通引物合成(<60base)23PAGE1.60/base2~53OPC1.30/base5~105PAGE2.20/base3OPC1.80/base205PAGE4.00/base3OPC3.20/base305PAGE5.80/base3OPC4.60/base506PAGE10.00/base4OPC8.00/base1007PAGE询价5OPC询价长链合成(60~90base)25PAGE3.50/base长链合成(90~120base)25PAGE5.00/base***生物科技有限公司的引物合成服务43（3）耐热DNA聚合酶1）TaqDNA聚合酶（Taqpolymerase）：95℃的半寿期为40min最适温度（72℃）时每个酶分子每秒可催化合成150个核苷酸酶活性（受多种因素影响）：5’→3’方向的聚合酶活性，5’→3’方向的外切酶活性和逆转录酶活性，非模板依赖性活性，可在双链PCR产物每一条链的3‘端加上单核苷酸尾，使PCR产物的3’端突出一个单A核苷酸尾44TthDNA聚合酶：在高温和MnCl2存在的条件下，能有效地逆转录RNA。用于一步法RT-PCR。VentDNA聚合酶：又称TliDNA聚合酶，该酶耐高温且具有3‘-5’外切酶活性的校对功能，其保真性较TaqDNA聚合酶高一倍。该酶扩增长片断（>12kb）的功能较强。PfuDNA聚合酶：具有3’→5’外切酶活性的校对功能，催化DNA合成的忠实性比Taq聚合酶高12倍，但不适于>2kb的片断扩增。2）其他的耐热聚合酶45（4）dNTP四种dNTP浓度应相等dNTP浓度：100~200μmol/L

浓度过高，影响DNA聚合酶的活性，且易产生错误碱基的掺入浓度过低则降低反应产量。

UNG酶可降解dUTP替代扩增产物46（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。

0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。

dNTP、EDTA等负离子的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。

Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。472）循环参数变性使双链DNA解链为单链

95oC20-30秒(2)退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合，降低温度可增加反应的灵敏性。48（3）延伸70-75oC，延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模板DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增加49二、PCR的衍生技术

逆转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）

反向PCR（inversePCR）

巢氏PCR（nestingPCR）

原位PCR（insituPCR）多重PCR（multiplexPCR）多重等位基因PCR（multiplexallelePCR）

不对称PCR（asymmertricPCR）

锚定PCR（anchoredPCR）

长片段PCR（longfragmentPCR）荧光定量PCR（fluorescentquantitativePCR）50逆转录酶DNA聚合酶活性mRNAcDNA杂化双链PCR扩增1、逆转录PCR

(reversetranscription-PCR,RT-PCR)

51影响因素（1）模板对RT-PCR的影响对RNA制品的纯度和完整性要求都极为严格（2）逆转录酶对RT-PCR的影响MLV逆转录酶能合成大于2kb的较长cDNA，但对热的稳定性较AMV逆转录酶差。（3）逆转录引物对RT-PCR的影响随机引物：原核细胞多用oligo(dT)：真核细胞多用基因特异性的引物（GSP）：特异性强，广谱性低52例子：S.pn的转化对PsaA基因mRNA表达的影响a、RNA的提取：野生型和转化缺陷型S.pn都诱导转化后，采用Qiagen试剂盒进行总RNA提取。b、cDNA的制备：取RNA2μl，随机引物1μl，DEPC水9μl，混匀后，70℃变性5min，立即置于冰上。然后顺序加入逆转录buffer5μl，dNTP1.5μl,RNasin0.5μl,DEPC水5μl,逆转录酶M-MLV1μl。混匀后于37℃，1小时，得到cDNA。c、PCR扩增:

PsaA的引物3μL，cDNA1μL，Tagplus酶0.2μL，共30μL体系。循环参数：94℃30秒，55℃40秒，72℃45秒，循环30次。用16srRNA的PCR产物为标准物，2%琼脂糖电泳。53

电泳结果用软件Quantity-one3.2进行半定量比较，结果进行配对t检验分析16S(463bp)PsaA(254bp)图2，2号菌株及其转化缺陷菌株在加入CSP后的不同时间PsaAmRNA的表达。

1234567图1，2号菌株及其转化缺陷菌株在加入CSP后的不同时间PsaA的RT-PCR电泳图。line1:Marker2.line2-4:0min,10min,20minafterS.pneumoniaeNo.2wasaddedCSP.line5-7:0min,10min,20minafterS.pneumoniaeNo.2dwasaddedCSP.

***542、反向PCR(inversePCR)

用反向的引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。应用：（1）用于测序的DNA大片段的克隆（2）获得启动子序列（3）小质粒的定点突变（4）鉴定插入失活基因或体内诱导基因55已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶反向PCR示意图56转化到大肠杆菌后，提取质粒，采用质粒引物即可直接对X片断进行扩增后测序，得到X基因序列信息。（10/64）EGFPXdw序列Xdw序列质粒引物质粒引物质粒引物例子：S.pn体内诱导基因序列的获得573、多重PCR(multiplexPCR)

用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物58图1第1、2、3组引物多重PCR电泳图

1：正常对照；2：DL2000marker；3~10：检出的缺失型患者杜氏/贝克型肌营养不良症一种常见的致死性神经-肌肉系统的X连锁隐性遗传病，其基因突变中缺失最常见，约占55%~65%，缺失分布的位点较多，随地域及民族的差异而有不同特点594、突变PCR（1）随机突变：应用：构建突变体文库，继而可从中筛选出具有特殊性质的突变个体策略：易错PCR（error-pronePCR）。利用TaqDNA聚合酶等耐热DNA聚合酶不具有3′→5′校对功能的特性，在PCR扩增反应中可能掺入错误的核苷酸，从而产生随机错误的扩增产物。加入次黄嘌呤核苷酸并限制某一种核苷酸的用量，从而促进DNA聚合酶选择其它3种核苷酸或次黄嘌呤核苷酸，导致扩增产物发生突变。60（2）定点突变（1）5‘端引入突变：通过修饰上游引物的5’端，即可引入标记的碱基、限制性酶切位点、启动子序列等。（2）序列中的单位点突变：采用重叠延伸PCR(OverlapExtensionPCR，OEPCR)61（A）为5‘端引入突变（B）为单碱基突变62例子：S.pn的ply146aa缺失的突变序列构建S.Pn的ply为一细胞毒性分子，其146位aa缺失后毒性大大减弱。构建突变体作为疫苗：首先设计4个引物：（M1和M2完全重叠）P1:5’-CGGGATCCATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3’BamHIP2:5’-CCGCTCGAGCAAGCATTCTCCTCTCCTAGTC-3’XhoIM1:5’-GGTCAATAATGTCCCAAGAATGCAGTATG-3’M2:5’-CATACTGCATTCTTGGGACATTATTGACC-3’63突变位点M2M1P2P15’5’5’3’3’5’为酶切位点序列以基因组DNA为模板，以P1和M1为引物扩增出ply上游片断，以P2和M2为引物扩增出ply下游片断以上下游片断为模板，以P1和P2为引物，扩出全长酶切后克隆到质粒中保存64（3）多位点突变策略：多次重叠PCR关键：重叠引物的设计（每对突变引物需要部分重叠，方向相反）。655、原位PCR(InSituPCR)原位PCR是由Hasse等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。66操作步骤1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2.PCR扩增细胞内目的片段3.原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达67三、实时荧光PCR技术

通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程；结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。68如何定量？Ct值的概念Ct值的定义：PCR扩增过