基因工程-克隆基因的表达

10/7/20231第七章克隆基因的表达10/7/20232遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程——中心法则（centraldogma）。一、基因表达：10/7/20233二、克隆基因的表达：外源基因在宿主细胞中表达。外源基因表达载体重组载体导入宿主细胞在宿主细胞中表达出蛋白质提取蛋白宿主细胞：原核细胞或真核细胞。10/7/2023410/7/20235第七章克隆基因的表达第一节外源基因在原核细胞中的表达第二节外源基因在真核细胞中的表达10/7/20236第一节外源基因在原核细胞中的表达一、原核生物基因表达的特点二、原核生物基因表达的调控三、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位四、几种类型的原核表达载体五、影响外源基因表达效率的因素10/7/20237六、提高表达水平常用的方法七、细菌表达载体举例八、外源蛋白质表达后的正确修饰九、原核细胞表达的缺陷10/7/20238用原核生物作宿主。AdividingE.coli第一节外源基因在原核细胞中的表达原核或噬菌体启动子MCSSD序列终止子10/7/20239识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。一、原核生物基因表达的特点2.以操纵子为单位1.只有一种RNA多聚酶10/7/202310有意义链5’反意义链3’转录mRNA5’3’翻译蛋白质NC5’3’3.转录和翻译偶联、连续进行。10/7/20231110/7/2023124.不含内含子，缺乏转录后的加工系统。5.调控主要在转录水平上。含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3’末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。6.mRNA的核糖体结合位点Shine-Dalgarno（S-D）sequence:10/7/202313是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensussequence）。二、原核生物基因表达的调控1.启动子-35Box和-10Box（1）启动子序列10/7/202314consensussequences10/7/2023155’-TTGACA-3’5’-TATAAT-3’②-10box（PribnowBox）TTGACATATAAT转录起始位点17bp5’核糖体结合位点RNA聚合酶σ亚基的识别位点。①-35box10/7/202316（2）翻译的起始位点1）Shine-Dalgarno（SD）sequence：mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。SDmRNA5’—AGGAGGU——AUG——16SrRNA3’UCCUCCAS-D序列距离AUG的距离也影响翻译10/7/202317全酶是一个5聚体，含有两个α小亚基，和2两个大亚基（β和β′），一个σ亚基。2.RNA多聚酶大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录tRNA，rRNA和mRNA。（1）结构10/7/2023183.转录终止子内终止子intrinsicterminator：E.coli中促使转录终止的DNA位置有一段反向回文顺序，其后紧接一串A，称为内终止子，形成终止信号。在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。启动子操纵子S-D序列目的基因终止子10/7/202319由于茎环3’段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。原因：反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA与DNA的互补。①茎环结构②多聚A/U10/7/2023205-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAACTTCTTTCT-33-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板)转录↓5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折叠↓mRNA折叠UCCUGG—CA—UC—GC—GG—CC—GC—GG—CAACCCACUUUU—3DNARNA聚合酶脱落10/7/20232110/7/202322大肠杆菌偏爱UAA。一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）。4.翻译终止密码5.翻译增强子Translationenhancer能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）;大肠杆菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的区段。10/7/202323①必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。②应呈现低水平的基础转录便于表达毒性蛋白等。③应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。（1）最佳启动子必须具备的条件6.基因工程常用的原核启动子10/7/202324来自大肠杆菌的乳糖操纵子。用乳糖或其类似物IPTG充当诱导物，与阻遏蛋白结合，解除抑制。PlacO目的基因（2）乳糖启动子lac10/7/202325阻遏物与操纵基因结合10/7/202326阻遏物与DNA的结合10/7/202327（3）色氨酸启动子trptrpRP1O

trpEtrpDP2trpCtrpBtrpAtrpR阻遏蛋白基因；P1P2启动子；O操纵基因；

衰减子来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。10/7/202328trpRP1O

trpEtrpDP2trpCtrpBtrpA邻氨基苯甲酸合成酶吲哚甘油硼酸合成酶色氨酸合成酶

链

链分支酸邻氨基苯甲酸磷酸核糖基邻氨基苯甲酸CDRP吲哚甘油-磷酸色氨酸阻遏物转录（P1是主要启动子，P2的作用只有3%。）没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，能转录合成色氨酸所需要的酶。10/7/202329trpRP1O

trpEtrpDP2trpCtrpBtrpA阻遏物色氨酸结合不转录用于表达载体的trp启动子一般只包含启动基因、操纵基因、和部分trpE基因。P1OtrpE目的基因有色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合后才能与操纵基因结合，从而阻止色氨酸合成酶类的转录（称为corepressor）。10/7/20233010/7/202331三、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位1.细胞质中表达2.周质中表达3.胞外表达10/7/202332三、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位1.细胞质中表达（1）包涵体（inclusionbody）是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。10/7/202333在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（humangrowthhormone,hGH）。例：使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞。回收的蛋白生物活性差。②缺点①优点10/7/20233410/7/20233510/7/2023362.周质中表达（1）周质（periplasm）革兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚优点：容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。10/7/202337phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、β-内酰胺酶（lactamase）、肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等常用的原核信号肽①大肠杆菌的信号肽：能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。（2）信号肽（signalpeptide）一般位于N端。10/7/202338④胡萝卜欧氏杆菌的PelB蛋白。②金黄色葡萄球菌的蛋白A。③枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶（endoglucanase）。10/7/202339由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合蛋白；使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。3.胞外表达或与细菌素释放蛋白（bacteriocinreleaseprotein)共表达。10/7/20234010/7/202341载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。S-D序列AUG-外源基因-TAG优点:四、几种类型的原核表达载体1.非融合型表达载体产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。10/7/202342哈佛大学的Gilbert实验室建立的。表达能力强。（1）pKK223-3载体组成结构：①强启动子:tac（trp-lac）:trp的-35区lacUV5的-10区lac操纵基因②操纵基因：乳糖操纵子系统。10/7/202343④终止子：③调节基因：LacI宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。如JM105菌。rrnB的强终止子rrnB强终止子S-D插入位点区⑤S-D序列和插入位点区：10/7/202344tacPLacOS-D插入位点区rrnBT宿主lacI⑥载体的其余部分：来自pBR322质粒。⑦表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）阻遏物IPTG10/7/202345必须选择一个有lacI（β-半乳糖苷酶的调节基因）的宿主菌。条件：10/7/202346载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。如：pINIII系列：2.分泌型表达载体pINIII-comA1,pINIII-comA2,pINIII-comA3,（1）组成结构10/7/202347IpplacPlacOS-D/AUGompa插入位点Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。②调节基因：lacI③S-D序列和起始密码AUG。④分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。⑤插入位点区（多克隆位点）。①强启动子：10/7/202348pINIII-comA1以pBR322为基础构建的。调节基因不必借助于宿主的lacI.10/7/202349表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。①启动子：tac②操纵基因：lacP③调节基因：lacI④S-D序列3.融合蛋白表达载体系统----pGEX系列（1）优点（2）组成结构便于融合蛋白的分离和纯化。10/7/202350lacItaclacOS-D/ATGGST插入位点TGAlacP⑤ori：pBR322ori⑥融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）GST融合蛋白用GlutathioneSepharose（谷胱甘肽琼脂糖凝胶）亲和层析柱分离纯化。（3）产物提纯10/7/202351（4）产物分离用凝血酶或Xa因子（一种丝氨酸蛋白酶）可以把外源蛋白从GST上切下来。柱（column）GST外源蛋白凝血酶外源蛋白柱（column）GSTGST洗脱柱（column）可再利用10/7/2023525’-TTGACA-3’5’-TATAAT-3’①-35box②-10box（PribnowBox）五、影响外源基因表达效率的因素1.启动子的结构对表达效率的影响RNA聚合酶σ亚基的识别位点（1）一致顺序10/7/202353（2）-35区与-10区之间的距离间隔为17bp时，启动子最强。（3）-35区和-10区的碱基顺序越接近一致顺序，启动子越强。5’-TTGACATATAAT一致顺序lactrp

PLrecAtacItacII5’-TTTACATATGTT5’-TTGACATTAACT5’-TTGACAGATACT5’-TTGATATATAAT5’-TTGACATATAAT5’-TTGACATTTAAT-35box-10box10/7/2023545’-AGGAGGU-3’S-D序列后面的4个碱基：如果是A（T）,翻译效率最高；如果是G（C）,效率只有50%或25%。2.转译起始序列对表达效率的影响（1）S-D序列？？？？10/7/202355AUG左侧的三个碱基也有影响。（2）起始密码AUG

-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效；如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。10/7/2023563.启动子与外源基因之间的距离10/7/202357转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费资源量和能量、不会干扰正常的表达。增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目。增加表达效率。4.转录终止区对表达效率的影响5.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。10/7/202358选择强启动子序列，如tac

等六、提高表达水平常用的方法2.调整S-D序列与AUG的距离距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离。3.改变起始密码下面的几组密码子能提高翻译的起始效率。10/7/2023594.增加mRNA的拷贝数和稳定性在外源基因的下游插入“重复性基因外回文序列”能防止mRNA受到3’

5’外切酶的攻击。5.减轻宿主细胞的代谢负荷合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。10/7/202360N末端：由原核基因编码一段多肽，C末端：是完整的真核外源基因。（1）设计成融合蛋白这是避免被降解的最好措施。质粒基因产物目的基因产物NC切割6.提高表达产物的稳定性防止被宿主的酶降解。10/7/202361①使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。②大肠杆菌的htpR基因突变也减少蛋白酶的降解作用。③T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。（2）使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。10/7/202362（3）表达分泌蛋白细胞质外膜内膜周间质质粒染色体“外排”：蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。“分泌”：蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。10/7/202363七、细菌表达载体举例colEorilacIinteinCBDMCST7PromotorAmprM13orirop维持拷贝数pTYB1，pTYB2，pTYB11，pTYB12几丁质结合1.pTYB1，pTYB2:intein在C端pTYB系列E.coli表达载体：10/7/202364intein指蛋白质的内含子。

同mRNA一样，一些前体蛋白质具有内含子(intein)序列，位于多肽序列的中间,经加工切除后，两端的蛋白质外显子(extein)连接为成熟蛋白质分子。

特点：

①.切割位点保守：

内含子前面常为半胱氨酸，后面序列是组氨酸－天门冬酰胺；内含子后面外显子序列的前面常是半胱氨酸、丝氨酸

和苏氨酸；存在一些保守序列。

②.具有自动切割加工能力：

如果蝇胚胎发育的内含子蛋白质(Hedgehog)。

③.蛋白质内含子片段具有核酸内切酶活性：

杂合体中，无内含子的DNA序列，经内含子的切割跳跃而成为纯合子。10/7/2023652.pTYB11，pTYB12:intein在N端10/7/202366利用Intein分离纯化外源蛋白Intein与Chitin柱结合DTT或β-巯基乙醇或半胱氨酸能够诱导Intein的自我裂解活性10/7/20236710/7/202368八、外源蛋白质表达后的正确修饰分子内二硫键、分子间二硫键。二硫键异构酶催化。使蛋白质能够正确折叠。1.形成正确的二硫键10/7/202369人胰岛素分子10/7/202370抗体分子人血红蛋白分子10/7/202371如信号肽、内含肽（intein）等序列的切割。2.前体切割10/7/202372（1）O-糖基化（Ser,Thr）增加蛋白质的稳定性和某些特殊性质。3.蛋白质糖基化糖基10/7/202373（2）N-糖基化（Asn）Dol：长醇Mannose：甘露糖Glucose：葡萄糖N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖10/7/202374磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、羰基化、豆冠酸化、软脂化4.氨基酸残基的修饰羟脯氨酸甲基组氨酸羟赖氨酸羧基谷氨酸10/7/202375缺乏蛋白质的加工。（如糖基化、氨基酸修饰等）。九、原核细胞表达的缺陷10/7/202376酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。第二节外源基因在真核细胞中的表达真核或病毒启动子MCSPolyA信号终止子外源基因10/7/202377①能在E.coli中克隆和扩增。1.酵母克隆载体一、在酵母中表达Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;④有合适的克隆位点。③有酵母的选择标记Ori②有大肠杆菌的选择标记Ampr、Tetr。10/7/202378Leu-

酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2、PEG整合到染色体上，或独立在酵母细胞内转化Leu营养缺陷型培养基筛选转化子克隆生长酵母载体大肠杆菌提取插入外源基因鉴定克隆发酵表达外源基因产物分离、纯化2.酵母转化和表达的一般过程10/7/202379诊断试剂丙肝病毒蛋白HIV-1抗原种类名称疫苗乙肝病毒表面抗原疟原虫环子孢子蛋白HIV-1外壳蛋白3.在啤酒酵母中表达的重组蛋白10/7/202380人类治疗用蛋白药物上皮生长因子胰岛素类胰岛素生长因子血小板源生长因子胰岛素前体成纤维细胞生长因子集落刺激因子

1抗胰蛋白酶凝血因子VIIIa10/7/202381（1）细胞质内表达例：人Cu/Zn-SOD在酵母中表达：4.在啤酒酵母中表达外源蛋白的方式超氧化物H+H2O2H2O过氧化物酶表达出的SOD修饰正确：起始氨基酸被切掉，第二个氨基酸丙氨酸也被乙酰化。SOD(超氧化物歧化酶)10/7/202382宿主：亮氨酸合成缺陷型酵母。GAPD：甘油醛磷酸脱氢酶10/7/202383（2）表达分泌型蛋白在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白质才能被糖基化。需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。方法：构建载体在重组蛋白的前面加一段编码酵母菌交配类型因子a1的前导肽，与重组蛋白的N端通过Lys-Arg相连。前导肽（leaderpeptide）：10/7/202384蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的内切蛋白酶识别这个切点信号，把重组蛋白正确切下来。信号肽的切割：前导肽Lys-Arg重组蛋白（水蛭素）内切蛋白酶10/7/2023855.其它酵母表达系统（1）乙肝表面抗原在嗜甲烷酵母中表达在大型发酵反应器中容易生长；以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。有甲醇时，表达的乙醇氧化酶高达胞内总蛋白的40%！①嗜甲烷酵母（Pichiapastoris）的特点10/7/202386HBsAg:乙肝表面抗原。可以作为疫苗。Aox1：乙醇氧化酶基因1启动子（受甲醇激活调控）。His4：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。3’-aox1：整合到特定染色体的位点序列。②表达载体构建（整合型）：诱导物：甲醇。产量：9×106剂疫苗/240L发酵液。10/7/202387整合到染色体中10/7/202388（2）牛溶菌酶C2在嗜甲醇酵母中的表达作为饲料添加剂促进反刍动物消化。产量：10L，200h连续发酵产出50g溶菌酶。10/7/202389二、昆虫培养细胞表达系统1.杆状病毒（Baculovirus）广泛侵染包括许多昆虫在内的无脊椎动物。（1）侵染周期：两种形式①单独病毒粒子形式病毒粒子宿主细胞病毒粒子侵染释放10/7/202390病毒粒子宿主细胞侵染宿主细胞侵染合成多角体蛋白裂解释放多面体溶解一般使用苜蓿银纹夜蛾细胞核型多角体病毒（Autographacaliforniamultiplenuclearpolyhedrosisvirus，AcMNPV）②多面体形式10/7/202391（2）杆状病毒的表达特点①感染后36-48h，病毒开始合成大量的多角蛋白。②多角蛋白的启动子特别强。③多角蛋白基因可以被替换掉而不影响病毒的繁殖。10/7/202392多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面体。3.转化子筛选通过显微镜检查看是否有多面体形成。源自草地夜蛾的细胞株，在这种细胞中，多角蛋白的启动子特别活跃。2.最普遍应用的宿主细胞株10/7/202393（1）转移载体的构建大肠杆菌质粒，插入两段AcMNPV序列以供同源重组。4.杆状病毒转化载体杆状病毒的基因组太大（13kb环状DNA），不能直接插入。必须使用同源重组的办法。多角蛋白的启动子和终止子及polyA加尾信号。启动子与终止子之间插入多克隆位点10/7/202394转移载体10/7/202395（2）杆状病毒载体转化过程①转移载体中插入外源基因②转移载体与野生型AcMNPVDNA共同转染宿主细胞③转移载体与病毒基因组发生双交换④外源基因被交换转入病毒基因组中⑤重组病毒侵染宿主4-5天后即可收获重组蛋白。10/7/20239610/7/2023974.目前已经用杆状病毒在真核生物细胞中表达的外源蛋白外源蛋白外源蛋白α干扰素腺苷酸脱氢酶β淀粉酶前体蛋白β干扰素Bluetonguevirus中和抗原红细胞生成素HIV-1外壳蛋白流感病毒凝集素白细胞介素2Lassavirus蛋白鼠单克隆抗体脊髓灰质炎病毒蛋白类狂犬病病毒蛋白狂犬病病毒糖蛋白Simianrotavirus外壳蛋白抗原组织型纤溶酶原激活剂10/7/2023985.杆状病毒大规模表达存在的问题杆状病毒侵染昆虫幼虫，在幼虫体内表达外源蛋白，成为“低成本蛋白工厂”。22只粉蚊夜蛾幼虫4天后表达的人腺苷酸脱氢酶占幼虫总蛋白的2%-5%。共产出9mg很纯的产物。（1）寿命短感染4-5天后宿主细胞裂解或幼虫死亡。（2）共同转染率低0.1%-1%。10/7/202399三、外源基因在植物中表达根瘤存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumorinducingplasmid）。1.Ti质粒:10/7/2023100Tiplasmid10/7/2023101环状双链DNA，1.5×105-2.0×105bp（185kb）(相当于细菌染色体的3%-5%）。（1）Ti质粒的结构10/7/2023102转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重要的部分。左边界右边界生长素基因细胞分裂素基因冠瘿碱合成基因①T-DNA（transfer-DNA）生长素基因:iaaM（tms1）和iaaH（tms2）编码合成吲哚乙酸（植物生长激素）的酶iaaM:色氨酸-2-单加氧酶10/7/2023103色氨酸-2-单加氧酶色氨酸吲哚-3-乙酰胺iaaH:吲哚-3-乙酰胺水解酶吲哚-3-乙酰胺水解酶吲哚-3-乙酰胺吲哚乙酸细胞分裂素基因tmr（ipt）：异戊烯转移酶,催化：二磷酸异戊烯（IPP）异戊烯酰嘌呤单磷酸（IPA）5’-AMP10/7/2023104②毒性基因（vir）决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移，进入和整合。vir的产物能诱导Ti质粒产生T-DNA区域的单链拷贝。单链拷贝从Ti质粒脱离后，可与vir的产物VIRD2蛋白结合，并在VIRD4和VIRB蛋白的帮助下穿过农杆菌内膜、外膜、壁和植物细胞壁、细胞膜及核膜，最后整合到植物染色体上。10/7/2023105章鱼碱代谢基因和胭脂碱代谢基因：④不相容性基因控制Ti质粒的不相容性。③冠瘿碱代谢基因分别编码代谢这两种冠瘿碱的酶。维持农杆菌生长。10/7/2023106（1）第一步:植物受伤植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁香酮、

羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的毒性基因表达。2.农杆菌的感染和生存10/7/2023107（2）第二步感染植物（3）第三步毒性基因（vir）表达T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。virA、virG、virD、virB（4）第四步T-DNA转移T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。（5）第五步诱导冠瘿瘤10/7/202310810/7/2023109（6）第六步土壤农杆菌代谢冠瘿碱。10/7/2023110裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子