基因治疗原理与研究进展

第十三章

基因治疗原理与研究进展

1根据靶细胞不同，基因治疗分为：体细胞(somaticcell)基因治疗生殖细胞(germline)基因治疗只限于某一体细胞的基因的改变只限于某个体的当代对缺陷的生殖细胞进行矫正当代及子代2基因治疗的概念将某个遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。31.基因治疗的策略

内容提要2.基因转移技术

4.治疗基因的受控表达3.基因干预5.基因治疗的应用研究6基因治疗的问题与展望4

第一节基因治疗的策略5一、基因置换（genereplacement）

定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，导入的正常基因，以置换基因组内原有的缺陷基因。

目的：将缺陷基因的异常序列进行校正。

特点：对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。6又称为基因打靶(genetargeting）定向整合的条件:转导基因的载体与基因组DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列交换。基因同源重组技术7缺陷基因正常基因重组载体正常基因定位重组技术染色体8二、基因添加

(geneaugmentation)定义：通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。类型：在有缺陷基因的细胞中导入相应正常基因，而细胞内缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。9定义：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。例如反义核酸、核酶或干扰RNA技术等。三、基因干预（geneinterference）10恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。原理:将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。四、自杀基因治疗11自杀基因的作用机制

12TK/GCV：单纯疱疹病毒（herpssimplexvirus,HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidine

kinase,tk）基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir,GCV）转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。（一）自杀基因系统13CD/5-FC：大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosinedeaminase,CD）基因，在细胞内将无毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）转变成毒性产物5-氟尿嘧啶（5-FU）。（一）自杀基因系统14旁观者效应：“自杀基因”导入后，不仅使导入了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻或远处的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。其明显增强了自杀基因的肿瘤杀伤作用。（二）旁观者效应15五、基因免疫治疗通过将抗癌免疫增强的细胞因子或主要组织相容性复合体（MHC）基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。16第二节基因转移技术

17基因治疗的两种方式载体目的基因invivoexvivo靶细胞将目的基因直接输入体内将目的基因导入患者靶细胞,体外培养将重组靶细胞回输体内18基因治疗的方式直接体内疗法（invivo）是指将目的基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。2.间接体内疗法（exvivo）是指在体外将目的基因导入靶细胞，经过筛选和增殖后将细胞回输给患者，使该基因在体内有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。19

基因转移(genetransfer)技术：

1.病毒介导的基因转移系统2.非病毒介导的基因转移系统20

一、病毒介导的基因转移系统

病毒载体介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是逆转录病毒载体。21（一）逆转录病毒（Retrovirus）载体+ssRNA逆转录酶核心蛋白膜蛋白人类免疫缺陷病毒（HIV）

22逆转录病毒的生活周期Ⅰ23逆转录病毒的生活周期Ⅱ24逆转录病毒的生活周期Ⅲ25（1）两端各有一长末端重复序列LTR。

1.逆转录病毒前病毒的结构特点（2）LTR由U3、R和U5三部分组成。U3内有增强子和启动子；U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS)

；在R内还有poly(A)加尾信号。

261.逆转录病毒前病毒的结构特点

（3）病毒有三个结构基因：gag、pol和env基因（4）5ˊ端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列（ψ）及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)。272.逆转录病毒介导的基因转移系统(1)逆转录病毒载体保留病毒颗粒的包装信号，而缺失病毒颗粒包装蛋白基因；它可以克隆并表达外源基因，但不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。LTRtherapeuticgeneLTR282.逆转录病毒介导的基因转移系统(2)辅助细胞株

它由另一种缺陷型逆转录病毒感染构建而成。该细胞株能合成包装蛋白，用于逆转录病毒载体包装。由于缺乏包装信号，本身不能被包装成病毒颗粒。gagpolenv29Retroviralpackagingsystem30逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。包装好的假病毒颗粒易于分离制备。逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。前病毒通过LTR高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。

3.逆转录病毒载体的特点

31

4.

逆转录病毒载体的主要缺点

随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳7kb以下的外源基因。32

（二）腺病毒(adenovirus，AV)载体33

（二）腺病毒(adenovirus，AV)载体腺病毒是一种大分子(36kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。

34腺病毒的优点1.基因导入效率高；2.宿主范围广；3.基因转导与细胞分裂无关；4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；5.腺病毒载体容量较大，可插入7.5kb外源基因。35

腺病毒载体缺点2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。3.有两个环节可能产生复制型腺病毒：载体与辅助细胞或患者体内野生型病毒发生重组。4.靶向性差。

1.不能整合到靶细胞的基因组DNA中。治疗基因表达时间相对较短。3637

（三）腺病毒相关病毒载体

(adenovirusassociatedvirus，AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。AAVVirusParticles37StructureofAAVVirusGenomicDNAREP:病毒复制基因,CAP:编码衣壳蛋白的基因ITR：反向末端重复序列ITRITR38AAV的特点●以潜伏感染为主；●AAV可以高效定点整合至人染色体中：可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达。39

AAV载体的缺陷：

40常用基因治疗载体

整合特点安全性感染细胞克隆容量逆转录病毒载体随机整合，效率高可能致病分裂细胞<7kb腺病毒载体不整合，可能丢失安全性较高分裂细胞、非分裂细胞

腺相关病毒载体定点整合安全性较高分裂细胞、非分裂细胞<5kb<7.5kb41二、非病毒载体介导的基因转移系统

（一）脂质体介导的基因转移技术

基本原理：利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。42脂质体介导的基因转移示意图43

（二）受体介导转移技术

将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。44受体介导转移技术示意图45

（三）基因直接注射技术

不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。动物实验：1.将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%～40%；2.将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；3.肌内注射凝血因子Ⅸ基因，可产生血友病所需的凝血因子Ⅸ。

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基因直接注射法的优点1.制备具有调控部件的质粒DNA重组体较容易；2.排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；3.导入的基因不需整合即可表达；4.基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。47第三节基因干预一、反义RNA二、RNA干扰三、核酶4849一、反义RNA（一）反义RNA与基因表达调控利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种：（1）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。（2）构建一些能转录反义RNA的重组质粒，将这些质粒转入细胞中，转录出反义RNA而发挥作用。4950

反义RNA的关键技术问题：☻反义RNA进入靶细胞前的降解问题☻专一性转移问题：

50512.受体介导反义RNA技转移术

①受体介导的RNA转移十分专一，而且效率高；②被转移的RNA是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层,可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。

将脱唾液酸血清类粘蛋白（ASGP）与多聚赖氨酸（PL）共价连接，得到ASGP-PL复合物，成为运载核酸的工具。ASGP-PL反义RNA复合物可以专一性地被肝细胞表面的ASGP受体所识别，并吞噬到肝细胞中，反义RNA进入肝细胞后，可被逐渐释放出来发挥作用。

借助前述的受体介导基因转移方法，可以实现受体介导的反义RNA转移。51

（三）反义RNA的应用前景

（l）安全性高（2）反义RNA设计和制备方便

（3）具有剂量调节效应

（4）能直接作用于一些RNA病毒52二、RNA干扰（RNAinterference，RNAi）由双链RNA介导的细胞内特异性mRNA降解过程，导致靶基因的表达沉默。5354RNA干扰过程主要有2个步骤：

（1）小干扰性RNA（siRNA）（2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断。长双链RNA被细胞内的双链RNA特异性核酸酶Dicer切成21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。（一）RNA干扰的机制54（一）RNA干扰机制示意图55（二）RNA干扰的应用前景

1.研究基因功能的新工具

2.肿瘤的基因治疗

3.病毒性疾病的基因治疗56三、核酶(ribozyme)

具有酶活性的RNA，可降解特异的mRNA序列。与靶序列互补的区域保守区域（构成酶活性的结构域）57核酶的作用机制

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（二）核酶的应用

与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA分子。

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第四节治疗基因的受控表达

治疗基因的受控表达包括控制治疗基因表达的时间、空间和水平三个方面。其策略大致有以下几种：基因内部调节机制、基因外部调节机制、利用病灶微环境使治疗基因特异性表达以及治疗基因的诱导表达等。

60☻使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件。

例：酪氨酸酶是皮肤细胞和黑色素瘤细胞产生色素途径中的一种酶，可利用其启动子驱动治疗基因只在黑色素瘤细胞中表达，而不在正常的周边细胞中表达。☻使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件。例：甲胎蛋白(AFP)基因正常情况下只在胚胎肝细胞中表达。肝细胞腺癌细胞中AFP基因异常激活，因此可利用该基因启动子驱动治疗基因(如自杀基因)在癌细胞中表达，使癌细胞经给药后被杀死。一、基因内部的调节机制61二、基因外部的调节机制

除利用基因内部的调节机制以外，还可通过施加外部刺激，比如对病灶局部进行热处理或电离辐射等，促进治疗基因在特定细胞或组织中表达。62三、利用病灶微环境使治疗基因特异性表达

病灶微环境与正常时往往不同，因此可利用这些变化控制治疗基因的表达。比如：肿瘤组织往往会出现葡萄糖缺乏或缺氧等微环境；炎症组织特殊微环境等。63四、治疗基因的诱导表达

为了防止其表达不再受外界控制，所以有必要开发和完善一些可诱导性基因表达系统。这种系统的必要成分：一种是转录激活剂，它与DNA结合的活性受某种诱导药物控制；另一种则是特异性基因表达调控元件，仅对这种转录激活剂有所响应。64四环素抗性操纵子系统原理四环素抗性基因的转录受Tet阻遏蛋白的负调控。无四环素存在时，阻遏蛋白与四环素抗性操纵子序列结合阻断四环素抗性基因的表达。四环素存在时，阻遏蛋白与四环素具有极高的亲和性，造成阻遏蛋白对四环素抗性操纵子阻遏解除，使四环素抗性基因的转录得以进行。。

65Tet-Off系统中，Tet控制的转录活化子（tTA）是野生型Tet阻遏蛋白（TetR）与一活化蛋白（AD）的融合体。66Tet-On系统中，TetR中四个氨基酸变化使其结合特性变为反向（rTetR)。在Dox存在时与TRE结合。67

第五节基因治疗的应用研究681．腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺乏症2．珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病3．血友病和其他血浆蛋白缺乏症4．苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病5．莱-纳(Lesch-Nyhan)综合征6．家族性高胆固醇血症7．囊性纤维化病一、遗传病的基因治疗研究

69第一例基因治疗

－腺苷脱氨酶缺乏症生理：腺苷脱氨酶是一种细胞内酶，在核酸代谢中起重要作用，使淋巴细胞中的脱氧腺苷脱氨成为脱氧肌苷，最后代谢为尿酸，排出体外。病理：腺苷脱氨酶缺乏－脱氧腺苷不能脱氨－脱氧腺细胞内堆积－淋巴细胞死亡－机体免疫功能缺乏。70治疗基础腺苷脱氨酶基因位于20号染色体长臂1983年腺苷脱氨酶基因被克隆应用逆转录病毒可将该基因送入缺乏腺苷脱氨酶基因的淋巴细胞新输入的腺苷脱氨酶基因可在原来没有此基因的淋巴细胞中表达

71ADA缺乏症FrenchAnderson(NIH)LTRADASV40neoLTRSeptember14,199072基因治疗的临床应用AshantideSilvaAshantiwasthefirstpatienttobetreatedwithgenetherapy.Injectionsrepeated7timesinfirst10