因工程制药工艺2

生物制药工程主讲教师：刘凯liukai_1982@163.com山东农业大学生命科学学院微生物系第六章基因工程制药工艺6.1基因工程制药微生物表达系统6.2基因工程大肠杆菌的构建6.3基因工程菌的发酵培养与控制基因工程技术—基因重组示意图DNA片段经酶切、连接，形成重组DNA分子导入宿主细胞系统中扩增目标基因表达，生成新产物，出现新性状6.2基因工程大肠杆菌的构建技术6.2.1构建流程6.2.2目标基因的克隆6.2.3表达载体构建6.2.4工程菌构建6.2.1工程菌构建流程目标基因克隆PCR、文库，化学合成表达载体构建酶切、连接遗传转化与筛选外源基因导入与培养工程菌新性状、功能、物质工作内容方法6.2.2目标基因的克隆策略目标基因：编码蛋白质或多肽的DNA序列正确克隆的重要性：只要有一个碱基发生（错义、无义、移码）突变，就导致编码氨基酸的变化，影响产物蛋白质的功能和生物学活性。只要一个碱基发生同义突变，就可能导致生产过程和效率变化。基因克隆方法的选择方法优点缺点PCR扩增简便快速，高效，数kb，单基因克隆DNA聚合酶活性和保真性限制文库筛选长片段，无碱基错误，未知序列基因克隆繁琐，过程复杂，耗时，昂贵化学合成简便，准确，已知序列，引物合成受合成仪器性能限制，长度很短PCR技术PCR（Polymerasechainreaction，聚合酶链式反应）：由DNA聚合酶催化下，对特定DNA序列进行的复制反应。本质：生物体的DNA复制原理在体外合成基因。发明者：Mullis，生物技术革命性象征，1993年获得诺贝尔化学奖。在引物指导下，以DNA为模板，由DNA聚合酶催化的扩增特定DNA序列聚合延伸形成互补序列的反应。3’AGCGAGGCATCG5’5’TCGCTCCGTAGC3’PCR单反应原理与过程(1)变性（94℃）(2)退火（55℃）(4)完成一个循环(3)延伸（72℃）PCR扩增的反应体系组成成分浓度用量作用缓冲液10x5ul提供反应环境dNTPs20mmol/L1ul反应的底物正向引物20umol/L2.5ul扩增的起始点反向引物20umol/L2.5ul扩增的终止点DNA聚合酶1-5U/ul1-2U催化，热稳定性MgCl21.5-5.0mmol/L1ulMg2+是辅酶模板DNA5-10ul含目标基因序列H2O27-33ul稀释总体积50ulPCR扩增产物电泳PCR仪水平电泳槽凝胶电泳6.2.2RT-PCR克隆目的基因流程提取RNA转cDNA设计合成引物基因片段的3’/5’末端扩增RT-PCR扩增全长基因基因片段扩增6.2.2RT-PCR克隆目的基因流程1提取RNA从表达基因的组织中提取总RNA，或mRNA可以用RNA提取kit,Unizol,Trizol大量提取时可以用传统的一步法提取--Unizol或Trizol是总RNA提取试剂，在配制过程中加入了异硫氢酸胍，能够在组织匀浆过程中迅速灭活RNA酶，保持RNA的完整性。总RNA提取操作步骤：1、细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。2、12,000rpm离心5min，弃沉淀。3、按200

l氯仿/mlTrizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。4、4℃12,000g离心15min。5、吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱，若只提RNA，则弃下层酚相。6、按0.5ml异丙醇/mlTrizol加入异丙醇混匀，室温放置5~10min。7、4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。8、按1ml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。9、4℃8,000g离心5min，尽量弃上清。10、室温晾干或真空干燥5~10min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。11、可用50

lH2O，TEbuffer溶解RNA样品，55~60℃,5~10min。注：H2O、TE须用DEPC处理并高压。RNA提取注意事项严格防止RNA酶污染1.佩戴一次性手套2.玻璃器皿可以在250℃烘箱中烘烤3小时3.枪头、Eppendorf管用0.1%DEPC（搅拌搅匀）水中浸泡。通风橱中室温过夜，扣去液体，高压灭菌30分钟。DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。4.DEPC处理的水：0.1%DEPC处理，高压灭菌30分钟脱毒5.防止环境中RNA酶污染2.转cDNA（防RNA酶）逆转录:将mRNA转录成为cDNA逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)

禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶

鼠白血病病毒(MLV)反转录酶,降解RNADNA杂交体中的RNA的能力较弱,对热的稳定性较AMV反转录酶差cDNA合成:1.总RNA2.底物，dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP3.引物,起始DNA的合成,oligo(dT)4.逆转录酶5.DEPC处理水温浴，按试剂盒说明书。3.引物设计特异性引物设计Specificprimer简并引物设计Degeneratedprimer嵌套引物Nested

Primer1）长度15~30bp2）AT:GC约50%，两引物Tm值接近，55~88℃之间。退火温度＝Tm(4GC＋2AT)－53）引物3’末端以G/C结尾较好4）不形成引物二聚体5）特异性,作BLAST搜索6）简并引物：保守序列；简并度低；具单一密码子的氨基酸放在3’端7）逆向引物要用互补序列引物设计原则1）特异性引物设计基因序列已知时,可以设计特异性引物特异性引物：有准确的碱基序列

F：XXXF，5’-

XXXXXXatggccgcttcgcgtgcaacg-3’

atggccgcttcgcgtgcaac

gtttgttgcgctcgtgtgcgctctcgcgctcgccgccgccgatgtgcagaatccgctcagtgacgatttcatcaatctcatcaacacaaagcaaaactct----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------aacgaagtcagggaccagggatcttgtggtagctgctggggttcggtgctgtggaggccatgaccgaccggtactgtacatactccaatggaactcaac

acttccatttctccgctga

tcagcggagaaatggaagtgt-3’R：XXXR，5’-

XXXXXX2）根据蛋白质同源序列设计简并引物DNAMAN当基因序列未知时,利用软件进行同源比对,设计间并引物用DNAMAN进行同源比对,设计引物将蛋白质序列保存为seq文件格式比对、系统树拷贝、保存4.RT-PCR扩增目的基因cDNA模板RNA/mRNAPCR扩增目的基因cDNAPrimerFPrimerRPCR循环94°C2’94°C30’’55°C45’’72°C1’72°C10’

25

lvolume10Xbuffer(含MgCl2)，2.5

l

2.5mMdNTP，2

lTemplatecDNA，1

lForwardPrimer，1

l

ReversePrimer，1

lDistilledWater，17.375

l

Taq酶，0.125

l

356.2.3酶切、连接、转化、筛选1.酶切反应概念：在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。5’突出端3’突出端平末端分析基因的限制性内切酶谱，确定插入质粒的限制性内切酶位点atgaactgtgtttgccgcctggtcctggtcgtgctgagcctgtggccagatacagctgtcgcccctgggccaccacctggcccccctcgagtttccccagaccctcgggccgagctggacagcaccgtgctcctgacccgctctctcctggcggacacgcggcagctggctgcacagctgagggacaaattcccagctgacggggaccacaacctggattccctgcccaccctggccatgagtgcgggggcactgggagctctacagctcccaggtgtgctgacaaggctgcgagcggacctactgtcctacctgcggcacgtgcagtggctgcgccgggcaggtggctcttccctgaagaccctggagcccgagctgggcaccctgcaggcccgactggaccggctgctgcgccggctgcagctcctgatgtcccgcctggccctgccccagccacccccggacccgccggcgcccccgctggcgcccccctcctcagcctgggggggcatcagggccgcccacgccatcctgggggggctgcacctgacacttgactgggccgtgaggggactgctgctgctgaagactcgg/酶切反应操作酶切体系组成：DNA，缓冲液，限制性内切酶反应条件：适宜温度（37℃），1小时以上终止反应：加热，加入EDTA，螯合镁离子电泳检查：酶切完全性超螺旋3.连接反应概念：在连接酶的催化下，将DNA双链上相邻的3’羟基和5’磷酸基团共价结合形成3-5磷酸二酯键，使两条断开的DNA链重新连接起来。连接反应操作连接体系：载体片段与基因片段，缓冲液，连接酶连接反应：16~26℃，数小时，或过夜终止反应：在70℃加热10分钟4.转化概念：把外源基因导入宿主细胞的过程。大肠杆菌转化—CaCl2法感受态细胞融化：置冰上，缓慢加入连接反应产物：混匀，置冰上30min热击：42℃，90s置冰上，1~2min扩增培养：加入LB培养基，37℃，45min涂平板：含有抗生素的LB固体培养基上