基因工程讲稿-1

基因工程GeneticEngineeringorGeneEngineering林拥军联系电话：87281719e-mail:yongjunlin@参考书1、基因工程原理；吴乃虎；科学出版社；20012、植物基因工程操作原理；王关林等；科学出版社；20003、基因工程；孙明；科学出版社；20064、AnIntroductiontoGeneticEngineering;D.S.T.Nicoll;CambridgeUniPress;20025、PrinciplesofGeneManipulation(6thedition);S.Primrose,R.Twyman,B.Old;BlackwellPublishing;2001主要的背景课《基因操作原理》《分子克隆》《分子生物学》《细胞工程》《遗传学》绪论一、基因工程概念二、基因工程研究内容三、基因工程的应用和发展一.基因工程概念在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的宿主细胞内，而能持续稳定的传替和表达。（吴乃虎2001）“Geneengineeringincludesarangeoftechniquesandmethodsusedbyscientiststocontrolormodifygenes,switchthemofformovethembetweentwounrelatedspecies.”一般意义上的基因工程是指“重组DNA技术”或“基因转移技术”，即：重组DNA筛选分离外源基因载体重组转化子整合基因工程图解：转化或转染受体细胞基因工程的四要素1、目的基因2、载体3、转化方法4、受体expressedsequenceregulatorysequencessuitablecodonusageforthehostortargetorganismprokaryoteveukaryotepost-transcriptionalissuescelllinevgermlinetransformation

Theterms'genetechnology',‘geneticmanipulation’,'geneticengineering'and'geneticmodification'meanthesamething,andrefertoonetypeofmodernbiotechnology.二.基因工程的研究内容1、基因的分离、克隆2、载体的选择及其构建3、基因转化受体系统的建立4、基因转化技术5、转化体的筛选6、外源基因整合和表达的检测7、外源基因在细胞中的表达调控8、外源基因的遗传9、基因工程的安全性三.基因工程的应用与发展1.基因工程的建立（1）理论基础：a、DNA是遗传信息的携带者（40s）；b、DNA能自我复制和传替（50s）；c、“中心法则”的提出和遗传密码子的通用性。目标基因的获得方法？基因工程的工具酶？载体？目的基因导入受体的方法？

由于这些问题的解决，人们期待的应用类似工程技术的程序，主动地改造生物的遗传特性，创造具有优良性状的生物新类型的美好愿望，从理论上讲已有可能变为现实。（2）技术基础：a、工具酶：限制性内切酶（1972年）、连接酶（1967年）。（核心技术）b、质粒载体c、受体的转化方法（3）基因工程的建立⋆1972年，美国斯坦福大学的Berg等率先完成了世界上第一次DNA重组试验。T4-DNALigaseSV40-DNA酶切片段+-DNA酶切片段重组体⋆1973年，斯坦福大学的Cohen等人进行的体外DNA重组试验。EcoRI重组DNA分子大肠杆菌转化获得能在卡那霉素和四环素双重抗生素上生长的转化子R6-5DNA（Kan+）+pSC101DNA（Tet+）⋆Cohen和Boyer合作，应用与上述类似的方法，把非洲爪蟾的编码核糖体基因的DNA片段，同pSC101质粒重组，并导入大肠杆菌细胞。转化子的分析结果表明，动物基因的确进入大肠杆菌细胞，并转录出相应的mRNA产物。至此，基因工程建立2、基因工程的应用与发展

基因工程自70年代初问世以来，经过三十多年的发展，无论是在基础研究领域，还是在生产实际应用方面，都取得了惊人的成绩。它不仅使整个生命科学研究发生了前所未有的深刻变化，而且也给工农业生产和国民经济发展带来了巨大的效益。我们已经很难说清究竟还有哪个生物科学领域没有受到它的直接或间接影响。Micro-organismsasfactoriesE.coliandyeastmakegoodfactoriesrapidgrowthsimple,cheapgrowthmediaandconditionsrelativelysimpletotransformandselectE.colifactoriescanmake:pigmentsantibioticsPharmaceuticals药品industrialenzymespesticidesinsulintetracyclinrennetHepatitisvaccinebialaphosBiopharmingwithtransgenicgoatsfoetalfibroblastcellsfroma30dayoldfoetuswereharvestedmicroinjectionwithahumangeneforATIIIreimplantationofthesinglecellsintothegoatuterusATIIIhasamarketasananticoagulantforpatientsundergoingcardiacsurgeryworldmarketofUS$200millioncanbesuppliedbylessthan100femalegoatsPicturefrommediareleaseMay,1999Transgenictripletsproducemilkwithbloodanticoagulantprotein（抗凝蛋白）ATIIIATIIIisfoundinnormalplasmaandregulatesbloodclottingPigwastemanagementPinanimalwasteisamajorenvironmentalconcernmostorganicPfromplantfoods(grains)isintheformofphytate（肌醇六磷酸）(myo-inositolhexakisdihydrogenphosphate)pigsandpoultryarethemajorculprits,astheylackthephytaseenzyme,hencearepoordigestersofphytatehence,theyrequire:supplementationwithinorganicPorphytaseinfeedameansofdealingwithexcessivePinpiggerywasteoreutrophication（富营养化）

occursGMpigsfromCanadagetphytaseexpressedinpigsalivaryglands（唾液腺）2components:Parotid（腮腺）

secretoryproteinpromoterE.coliappAphytasegeneMicroinjectionof4,147embryosproduced33transgenicpiglets14pigletsproduced>5U/mlphytaseinsalivafromprogenies,1linewasprocuredwhichproduced2,420U/mlphytasethesepigswerefedonsoybeanandnoPsupplementOutcome:allphytatewasdigested75%reductioninPinfaecalwasteGolovanetal,(2001)NatureBiotechnology,19:741-745CohoSalmon(Devlinetal.1994)Growthhormoneexpressedincoldwaters,unlinkedfromtemperaturecue.Novelgeneconstruct:strongpromoter(sockeyeMT)+extragrowthhormonegene(sockeyeGH).Mudloach(Nametal.2001)

-actinpromoterlinkedtoGHgene.Growthincrease>30fold.Gigantism.Age=6months已获成功的转基因植物植物至少35科200种性状抗虫、抗病（病毒、细菌和真菌性病害）抗除草剂抗逆境（抗旱、抗渍、抗高温冷害等）品质改良、生长发育调控、产量潜力ATTRIBUTES1Herbicidetoleranceallowsgrowerstoutilizelowercostherbicidesthataregentlerontheenvironment.Cropsaregeneticallyimprovedtotoleratecertainherbicidessothatweedsarecontrolledandthecropthrives.HerbicideTolerantPestResistantInsectsdestroyover$1billionincropseachyear.Btcropsproduceaproteinthateliminatestargetedpests.Btnaturallydestroytheirowninsectpredators.2ATTRIBUTESCropdiseasesreducesyieldandquality.Biotechtransfersnewdiseasefightinggeneintocropplants.Cropsaregeneticallyenhancedtonaturallyresistdisease.DiseaseResistant3ATTRIBUTESIncreasingYields

Stress-tolerance

4BENEFITSbiotechnologyIncreasedavailabilityoffruits&vegetablesLowersaturatedfatHigherlevelsofvitaminsEdiblevaccines5Health&NutritionBENEFITSbiotechnologyRoundUpReadycrops

EPSP合成酶

莽草酸

5-磷酸莽草酸

5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸

分枝酸

邻-氨基苯甲酸预苯酸

色氨酸

酪氨酸

苯丙氨酸

草甘膦抑制EPSP合成酶活性

结果：莽草酸途径被抑制，造成植物芳香族氨基酸的缺乏获得抗除草剂转基因植物的方法:EPSP合成酶的过量表达

对除草剂不敏感的EPSP合成酶

除草剂的解毒基因Btcrops

Bacillusthuringiensis(Bt)toxinisaninsecticidalproteininthenaturalstate,theprotoxiniscleavedintheinsectmidgutby:proteaseactivityalkalinepHBttoxinshavebeenusedasbiopesticidessincethe1960sBtcropsarenowbeinggrowninternationally:

cottonmaizepotatoFattyacidbiosynthesisGeneralisedpathwaysaturatedfat monunsaturatedfat polyunsaturatedfat

Δ18desaturase Δ12desaturaseexamplesstearicacid oleicacid linoleicacidincreasemonounsaturatedoilsGoldenricevitaminA=retinol-producedbyanimalsinliver,milkandeggsplantsdonotproducevitA-butsomeproduceß-carotene,aprecursorforvitAincluding“yellowvegetables”,yellowendospermcornandsorghuminmanydevelopingcountries,vitAdeficiencyisamajorproblem:眼球干燥症–失明免疫功能下降\\\\Goldenrice-endospermspecificexpressionofa3-steppathwayBasicsubstrate-牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(GGPP)GGPP+GGPPphytoenelycopeneß-carotene(provitaminA)phytoenesynthase(1)phytoenedesaturase(2)lycopenebeta-cyclase(3)Sourceofgenesencodingenzymes:(1)+(2)fromdaffodil（水仙）Narcissuspseudonarcissus(3)frombacteriumErwiniauredovora（八氢番茄红素）（番茄红素）ImprovingthenutritionalvalueofGoldenRicethroughincreasedpro-vitaminAcontentPaineetal.Nat.Biotechnol.

23,482-487(2005)apsyfrommaizesubstantiallyincreasedcarotenoidaccumulationanincreaseintotalcarotenoidsofupto23-fold(maximum37µg/g)comparedtotheoriginalGoldenRiceVaccinesfromplants?ORWhichformofvaccinewouldyouratherhave?Whichformwouldyourathergivetoachild?Transgenicplantshavebeenshowntoproducevaccines,suchasoneforHepatitisB,whichisdemonstrablyeffectiveinmicedemonstratedintobacco,potatoproblem-mustbeextractedorislostinprocessingfreshfruitorvegetableistheonlypossiblemechanismofdeliverybananapapayaappletomatoMedicinalhoneyfromGMplantsnectarfromGMcropsbeusedtoproducehoneycontainingdrugs/vaccinescasestudyfromUniversityofWageningen:GMpetuniaswithaparvovirusvaccinetofeedtodogsevidenceshowsthatthesugarsinhoneymayalsoprotecttheprotein(vaccine)whichwouldotherwiserequirerefrigerationthinkoftheadvantagesintropicalcountries!第一章目的基因的克隆策略一、基因克隆的目的与意义

Isolationofageneenablesthedeterminationofitsnucleotidesequence.Fromthisinformationtheinternallandmarksofthegenecanbedetermined–forexample,intronnumberandposition;promoterelements.

AcomparisonofDNAsequencesbetweengenescanleadtoinsightsingeneevolution.ConvertingtheDNAsequenceofageneintoaminoacidsequencebyusingthegeneticcodeleadstoadeterminationofthestructureoftheproteinproductofthegene,andfromthisknowledge,thefunctionofthegenecanbeinferred.

Agenecanbemovedfromoneorganismtoanother.Anorganismcontaininga"foreign"geneviageneticengineeringprocessiscalledtransgenic.Transgenicorganismscanbeusedeitherforlaboratoryresearchtoadvanceourunderstandingofbiologicalprocessesorforspecializedindustrialapplications–forexamples:DevelopmentofinsectresistantcropsProductionofhumaninsulinintransgenicbacteriacarryingappropriatehumangene二、图位克隆法（Map-basedcloning）٭

90年代初发展起来的基因克隆技术。目前，绝大多数分离克隆的基因都是通过这种方法获得的。٭

图位克隆法是基于基因在遗传图谱上的位置而分离克隆基因的方法。٭

图位克隆法包括以下步骤：(a)Targetgenemapping:ahighresolutiongeneticmapwithaveragedistanceislessthan2cM.(b)Physicalmapping:amapofthelocationsofidentifiablelandmarksonDNA,regardlessofinheritance.Distanceismeasuredinbasepairsotherthangeneticrecombination(incM).MethodsforphysicalmappinginvolveFISH,YACs,BACs,STSs(sequencetaggedsites).(c)

Chromosomewalkingorlanding:--ChromosomewalkingreliesonisolationofaDNAfragmentatornearanendofaclonedinsertforuseasaprobetoscreenthelibraryandidentifymoreclones.--Chromosomallanding:Startwithidentifyingtightlylinkedmolecularmarkers.TheDNAmarkersarethenusedtoscreenalibraryandisolate(orlandon)theclonecontainingthegene.(d)Geneidentification:Geneticcomplementationthroughtransformation.举例：基因的克隆构建作图群体（F2、RIL、DH或NIL）分子标记作区段高密度遗传连锁图Chr基因Xigfhedcba1.8cM3.5cM0.5cM1.2cM0.8cM以距基因最近的两侧分子标记筛选文库（BAC,PACorYAC文库），分离片段末端进行染色体步查（chromosomewalking)walkinglandinggef1.8cM0.5cMXgene文库片段测序Genscan和Blast，候选基因确定转基因功能验证三、mRNA

差异显示法(未知序列基因克隆）mRNAdifferentialdisplay3’锚定引物5’随机引物放射性标记•ReamplifyandconfirmbyNorthernblot•Cloneandsequence•Conductfurtherstudies:Cutoutdifferentiallyexpressedbandsand:•Generatefull-lengthcDNAs•Obtaingenomicclonesorregulatorysequences该方法的优缺点：优点：

（1）可以同时比较多个样品间基因表达差异；（2）可以同时检测到“上游”及“下游”基因；（3）检测灵敏度高，所需样品少，一些低丰度mRNA也能被检测出来；

缺点：（1）假阳性的比例甚高，假阳性率高达50~70%；（2）扩增的差别条带的分子长度比较短，大多在110-450bp之间。

※扣除杂交是比较两个群体的mRNA表达差异，从而克隆仅在其中一个群体中表达的基因的有力的方法。

原理：首先，把两个群体分离的mRNA反转录成cDNA；我们把含有特异基因表达的群体的cDNA做“tester”，参照群体的cDNAs为driver；然后在driver过量的情况下将两者进行杂交，除去杂交的序列；结果，那些未杂交的cDNAs即是tester中特异表达的mRNA.四、基因组扣除杂交法(未知序列基因克隆）（genomicsubtractionhybridization)

※特别实用于分离在特定组织中表达的基因，在细胞周期特定阶段表达的基因，受生长因子调节的基因，以及在特定发育阶段表达的或者是参与发育调节的基因。同时亦可有效分离经特殊处理而诱导表达的基因。工作流程：cDNAsynthesisTesteranddriverdscDNAarepreparedfromthetwomRNAsamplesundercomparison.RsaIdigestionTesteranddrivercDNAareseparatelydigestedtoobtainshorter,blunt-endedmolecules.AdaptorligationTwotesterpopulationsarecreatedwithdifferentadaptors,butdrivercDNAhasnoadaptors.FirsthybridizationHybridizationkineticsleadtoequalizationa