借助于细胞大规模培养的生物制药工程与科学问题研究

借助于细胞大规模培养的生物制药工程与科学问题研究华东理工大学张嗣良2009.4发酵工程产品生产过程微生物培养生物反应器产品代谢（表达）产物生物转化酶（生物催化剂）酶反应（生物催化）分离制品质量标准包装仓库运输…

原料：碳氢化合物碳水化合物…医药、食品、化工品、酶制剂、能源、环境保护、…生产菌株生物反应器过程细胞株：生物反应器过程研究工程化中的关键问题功能基因、功能蛋白、组合化学…

基因工程药物、药物新靶点、酶制剂工业生物技术:食品与营养、健康与环境、资源与能源等重大问题科学问题？高生产率：明显的成本优势以生物过程的科学问题作为基础理论研究以关键技术和共性技术开展应用基础研究产品为对象的工艺、工程、装备一体化应用技术研究头孢菌素C发酵过程放大

50升发酵罐（FUS-50L(A)）：平均4万u/ml，最高达4.5万u/ml，用油少

l80m3工业发酵罐：平均2.5万u/ml

，最高达3万u/ml，用油增加30%?试验结果

大罐与小罐比较:RQ值差异

32小时前，大罐与小罐的RQ值接近

32小时大罐RQ值升高

70小时左右，大小罐RQ值下降，但小罐更低。

桨型的计算流体力学仿真

通气量从0.5vvm提高到1.2vvm时，发现桨间流型干扰气含量分层现象严重通气短路现象结论搅拌系统(560kw/180m3≈3.2kw/m3)

设计不合理引起工业生产罐混和不均的严重问题出现发酵100小时高耗氧时的供氧不足出现顶部加油区到发酵底部的含油浓度梯度，虽然生产大罐加油量大，但实际耗油量减少引起脂肪酶的诱导不均一性发酵单位下降，用油成本增加，含油发酵液提取困难，影响产品质量改造后搅拌桨模型初步改造结果2.5-3.0万u/ml──→3.5万u/ml维生素B12好氧工业发酵优化不同搅拌转速下的耗氧率（OUR）

──氧调控机制的发现Yx/sYp/smoYp/s

Yx/smo恒化器(chemostat)与宏观动力学研究13C微观代谢流测试批发酵、动态生长与生产阶段中心代谢与次级代谢研究结果脱氮假单胞菌(P.denitrificans)具有极高的的氧亲和力（Qmax）控制不同的耗氧率，有不同的菌体生长和产物生产率发现TCA回补途径的重要作用搅拌转速与通气、前体补入与溶解CO2控制是关键优化的生物反应器流场设计(O2、CO2)和操作──工业生产放大90μg/ml→190μg/ml阿维菌素发酵过程优化4000u/ml阿维菌素形态与搅拌计算流体力学100M3发酵罐摇瓶2000u/ml4500u/ml补料操作优化发酵过程中pH基本没有变化，OUR、CER也基本没有变化，但是阿维菌素的合成速率提高，最终5050μg/ml，比对照罐批提高了30%。葡萄糖补入速率过快参照过程pH变化加入葡萄糖由于呼吸强度增加，OUR、CER明显增强，初级代谢加强，导致EMP、TCA途径中有机酸的积累，pH快速下降，阿维菌素的效价只有3600μg/ml，低于对照组。碳水化合物运输和代谢为例差异蛋白质分析

S.avermitilis

在TSB（左）和复合培养基（右）中差异表达蛋白点（碳代谢）。“○”代表复合培养基上调蛋白点；“□”代表复合培养基中下调蛋白点amyA2编码的α淀粉酶icdA编码的异柠檬酸脱氢酶132种蛋白中，按功能进行分类主要参与:碳水化合物运输和代谢、氨基酸的运输和代谢、核苷酸的运输和代谢、能量产生和转换、次级代谢物的合成与调控以及信号转导等过程。Microarray

视觉图生物芯片中心SOM分析Avermectins合成速率与基因表达宏观与微观代谢研究的相关性S.avermitilis工业菌株在复合培养基：OUR、CER、pH、补糖操作的实验结果碳水化合物运输和代谢的差异蛋白质分析30小时耗氧率OUR下降。这也体现了发酵过程中降低能荷，使代谢流向次级代谢迁移的调控思路。这时阿维菌素开始形成，这与表现出较高的协迫蛋白表达是一致的，也说明次级代谢物合成的启动。与参数相关分析一致：转速、补糖控制、pH、OUR、形态微生物过程研究的进展细胞外可操作因素从细胞内到细胞外化学工程与控制工程的学科原理，黑箱系统，局限性很大菌种、发酵、装备研究互相割裂细胞内生理特性研究生命科学与生物技术发展由宏观到微观细胞内生命科学研究的深入20世纪生物学经历了由宏观到微观的发展，特别是系统生物学不同于以往的生物学——仅关心个别的基因和蛋白质，它要研究的是所有的基因、转录谱、蛋白质、代谢谱、组分间的所有相互关系，是以对生物的全域性（global）研究为特征的。环境组学的提出生理特性与外界环境生物体系对外界环境条件的适应性和自我调整是菌体生理特性与外界环境的基本特征，这也就是生物过程放大时要考虑的基本科学问题。外界环境对细胞生理特性的影响主要表现形式细胞的信号传导系统对外界环境条件的响应，引起细胞转录表达系统的变化，进而引起细胞代谢网络的变化。外界环境（如温度、pH）对菌体胞内酶的作用或代谢速率所产生的影响；由于反应器混合传递所引起的基质（如氧、各种碳源、氮源）供应不足或过量，由此产生的胞内代谢的变化（能量、代谢流、代谢网络结构等）；细胞的群体效应：菌龄的非一致性；菌间的相互作用信号转导模式

外界信号刺激HPKPRRHPKRRPDNA转录水平Proteinproducts膜外配体结合区ATPADPHis位点Asn这种影响是相互的

这种环境因素（或者称“环境组”，envirome）

与菌体代谢的相互影响环境组学研究把工业微生物发酵反应器体系作为相对封闭的生态系统，作为系统生物学研究的一部分：用系统生物学的方法开展全域性（global）研究微生物与外在环境相互作用关系基因组表达的时序及环境适用性和相互作用蛋白质组的时序及环境适用性和相互作用代谢组的时序及环境适用性研究与生物过程研究相联系：时变、动态高度分支科学研究与发酵过程全局优化过程优化的切入点？因此，在大量的原始数据和原始资料中提取出具有明确生物意义的生物信息就成为重要问题。但是由单一生理调控机制出发做出的研究只是揭示了生理调控的局部和某一时段的特点，因此难于对全局优化起决定性作用。如何整体性看待遗传和生理特性，把宏观研究与微观研究相结合就成为很重要的问题。

复杂系统多尺度观点的应用──工程学方法生物细胞基因尺度细胞尺度反应器尺度生物反应器信号转导动力学因子代谢流内部反馈环境变量加氮源稀释率搅拌通气加碳源加前体加酸加碱加热……操作变量时间尺度与空间尺度以多尺度参数相关的理论方法解决单一生理调控机制出发的研究缺乏全局性概念的问题。呈网络多输入多输出关系不是简单的统计热力学关系网络结构表现在不同尺度的网络状态的互动关系───多输入多输出关系

能量流、物质流、信息流生命属性所特有的时空串联反应关系微生物代谢流───网络研究的的核心问题多尺度参数相关分析每个尺度都有不同的学科原理和变化规律研究它们的量变到质变，以及由此形成的对复杂系统总体的影响导致发酵过程参数相关性响应的原理与方法在众多因素的海量数据中找出发酵过程全局优化的敏感生理参数。

跨尺度观察与操作工业过程通常只在反应器尺度上进行测量与操作可以从低一尺度层次来预测另一尺度层次的规律

DO-发酵液中溶解氧浓度、OUR-菌体代谢耗氧速率、CER-二氧化碳释放速率、RQ-呼吸商-代谢途径、KLa-生物反应器中氧传递速率、pH酸碱度、菌体浓度、…等40多个参数

9-25小时之间RQ呈低谷状必需限制补葡萄糖新型食品添加剂呈味核苷酸二钠生产关键技术优化研究

参数相关分析与状态方程建立

通过鸟苷发酵过程的数据采集发现：4040小时OUR下降，耗糖速率增加，氨氮用量增加

鸟苷产率迅速下降──代谢流迁移生物反应器：测量观察值多尺度：细胞代谢流？状态方程建立与系统识别

17种氨基酸的时序变化

纸层析分析有机酸的积累

实测结果：代谢流分析35小时：丙酮酸、丙氨酸积累

代谢途径迁移的酶学测试

───HMP途经→EMP途经磷酸果糖激酶

磷酸葡萄糖脱氢酶

丙酮酸激酶

柠檬酸合成酶

丙氨酸脱氢酶

跨尺度分析与工艺改进

确定以代谢流由EMP向HMP途径回复迁移为目标进行过程工艺优化，并以OUR的下降作为跨尺度操作的相关因子发现调控因子A加入后短期内OUR的下降速度就开始放慢，到48小时开始维持稳定直至放罐，并且发酵后期的糖耗速率也变慢

关键技术工艺改进后实施效果小试与中试规模：

17.2克/L→34克/L(60小时)

100M3生产规模：

16克/L→32克/L(60小时)

生物反应器过程放大生物过程放大的困难放大时不可能同时做到几何相似、流体运动学相似和流体动力学相似，当在小试研究时某一个对生产产生影响的重要因素没有被观察到，而这个因素恰恰在放大时成为关键因子时，就会造成整个发酵过程放大的失败。此外，传统发酵优化在考察环境对菌体发酵的影响时往往将环境因素看为均匀的平均值，而且只关注其对发酵最终结果的影响，由此建立的大多是非结构化的细胞发酵动力学模型。流场特性可归结为生物反应器内流体力学研究所得到的流场特性，在这些流场作用下对菌体生理特性的影响。温度梯度对代谢的影响浓度梯度对代谢的影响溶氧水平对代谢的影响剪切对菌体活力的影响通过将两者整合起来研究其相互作用规律，有可能为生物反应器的优化与放大开辟一条新的科学思路

流场特性与生理特性研究相结合的放大原理流场特性CFD模拟生理特性研究多尺度参数相关分析环境特性研究（细胞内生命过程）（多相流场复杂系统）放大原理的实现高吨位发酵罐放大370m3发酵罐红霉素发酵过程放大计算流体力学（FCD）

模拟结果比较——气含率分布整个罐体中气体能得到较