病毒性肝炎的病原检测

病毒性肝炎的病原检测李刚中山大学附属第三医院感染病科

甲型肝炎⑴抗HAVIgM：病后数天即可阳性，3～6月转阴。是早期诊断甲型肝炎最简便而可靠的血清学标志。⑵抗HAVIgG：出现稍晚，于2～3个月达到高峰，持续多年或终身。抗HAVIgG阳性表示受过HAV感染。属于保护性抗体，具有免疫力的标志。穗港人群不同年龄抗HAVIgG阳性率年龄广州香港阳性数/检测数（%）阳性数/检测数（%）<1045/149（30.2%）3/51（5.8%）10~156/337（46.3%）10/84（11.9%）20~179/267（67.0%）21/91（23.1%）30~90/127（70.9%）67/94（71.3%）40~93/104（89.4%）344/414（83.1%）合计563/984（57.2%）445/734（60.6%）HBV基因及编码蛋白乙型肝炎血清学标志物检测技术发展史推出年代检测方法检测下线评论1960放射免疫分析法pg,fg孵育时间长，污染，不能全自动化1970酶免疫分析法ng结果不稳定,线性区间较小1980荧光/化学发光/增强化学发光ng,pg1996电化学发光pg最新,最先进目前市场情况1大多采用酶免检测方法

(1)1970酶免疫分析法ng水平(2)突变HBsAg的不能检出或检出能力明显降低（3）E抗原无法定量(4)检测周期长2化学发光检测逐渐增加

收费标准已建立广东:40元/T

乙型肝炎一、HBsAg与抗HBs

HBsAg在感染HBV两周后即可阳性。只要HBsAg阳性就可诊断HBV感染，阴性则不能排除HBV感染。

抗HBs为保护性抗体，阳性表示对HBV有免疫力。低滴度应注意假阳性。乙型肝炎HBsAg与抗HBs

HBV感染后可出现HBsAg和抗HBs同时阴性，即所谓窗口期，此时HBsAg已消失，抗HBs仍未产生，少部分病例始终不产生抗HBs。HBsAg和抗HBs同时阳性可出现在HBV感染恢复期，此时HBsAg未消失，抗HBs已产生；另一情形是S基因区发生变异，野生株抗HBs不能将其清除；或抗HBs阳性者感染了免疫逃避株。HBsAg定量稀释度1:512

光密度S/CO

截止值COI

纳克ng

HBsAg★化学发光:敏感性更高（0.03ng/mL），ELISA的10倍特异性更强检测突变更出色精密度更高，小于5%；ELISA为20%

检测线性范围更广，0.03～

400ng/mL

ELISA

0.2～

50ng/mLHBsAg★常用ELISA法检测。★目前HBsAg诊断试剂质量较高，灵敏度可达0.2ng/L。从全国室间质控评价结果显示，阳性标本检出率达到或超过98％。★HBsAg滴度越高，HBeAg、HBVDNA阳性的可能性越大。★血液与肝组织的HBsAg含量并不完全相关。为什么血清HBsAg阴性不能排除HBV感染？★检测试剂不够敏感。Abbott试剂盒由ad亚型抗体和抗原制备，对ay亚型的灵敏度较低。★S基因变异（抗原性发生改变）。★X基因变异（转录受抑制）。★重叠HCV感染（干扰HBsAg合成）。如何诊断血清HBsAg阴性的HBV感染？★提高检测敏感性—表面等离子共振生物传感—非竞争性毛细管电泳—免疫传感—纳米磁性微球★采用针对变异抗原的检测试剂★HBVDNA的检测★组织中标志物的检测抗HBs￭ELISA:半定量￭电化学发光:2～

1000IU/L抗HBs阳性就万无一失了吗？￭

低滴度应注意假阳性￭单一抗HBs阳性HBVDNA检出率0-11.8%：

★先后感染了不同的HBV亚型

★S基因变异

★X基因变异

指示免疫应答Anti－HBS(IU/l)接种的要求 <10立即11-1003-6月后101－10001年后1001－1000031/2年后>10000 7年后HBsAg与抗HBs共存★可出现在HBV感染的恢复期，此时HBsAg未消失，抗HBs已产生，大部分归功于检测敏感性的提高。★S基因发生变异，野生株抗HBs不能将其清除；★抗HBs阳性者感染了不同亚型HBV或免疫逃避株。基因变异导致HBsAg与抗HBs共存★aa126苏氨酸丝、异亮氨酸★aa141赖氨酸谷氨酸★aa145甘氨酸精氨酸★前S1nt3025-3154缺失乙型肝炎

HBeAg与抗HBeHBeAg的存在表示病毒复制活跃且有较强的传染性。HBeAg消失而抗HBe产生称为血清转换。抗HBe阳转后，病毒复制多处于静止状态，传染性降低。但长期抗HBe阳性者并不代表病毒复制停止或无传染性，研究显示20%～50%仍可检测到HBVDNA，部分可能由于前C区基因变异，导致不能形成HBeAg。HBeAg定量S/COCOIPEIU/mL(Paul-ErlichInstitute)HBeAg

★是重要的免疫耐受因子，大部分情况下其存在表示患者处于高感染低应答期。

★HBeAg与HBVDNA有良好的相关性。★阳性标本HBVDNA检出率90％左右。HBeAg水平与HBVDNA的关系★HBeAg0.28～134PEIU/L,HBVDNA5.58±1.84e

。

★HBeAg＞134PEIU/L,HBVDNA6.93±1.03e。HBeAg阴性/抗HBe阳性，HBVDNA阳性HBV感染

★HBVDNA水平一般较低。★90%以上由于nt1896位突变引起。乙型肝炎

HBcAg与抗HBc

HBcAg阳性表示血清中存在Dane颗粒，HBV处于复制状态，有传染性。常规不作为检测项目抗HBcIgM是HBV感染后较早出现的抗体，绝大多数出现在发病第一周，多数在6个月内消失。高滴度的抗HBcIgM对诊断急性乙型肝炎或慢性乙型肝炎急性发作有帮助。抗HBcIgM

>100PEIU/mL急性<100PEIU/mL慢性乙型肝炎抗HBc抗HBcIgG绝大部分HBV感染者为阳性，因为HBcAg的抗原性很强。

单一抗HBcIgG阳性者可以是过去感染，因其可长期存在；亦可以是低水平感染，特别是高滴度者。抗HBc阴性的原因

★免疫耐受。★检测试剂原因，目前试剂准确性约85%。★C区突变。

HBVDNA检测的临床意义⒈诊断方面：⑴HBVDNA是HBV存在最直接的依据⑵HBVDNA是HBV复制的标志⑶HBVDNA是患者具有传染性的标志HBVDNA检测的临床意义

⑷对HBV-M起补充作用：①HBeAg(﹣)/抗HBe(﹢)乙型肝炎（前C区变异）②HBsAg(﹣)乙型肝炎（S区变异）③低水平感染单项抗HBc(﹢)乙型肝炎

HBVDNA检测的临床意义⒉疗效判断：HBVDNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标

HBVDNA1IU=5copies100IU=500copiesHCVRNA1IU=2copies100IU=200copiesHBVDNA1IU=5.3copies(Amplicor)1IU=5.6copies(Versant)1IU=5.8copies(TaqMan)HBVDNA500copies=

95.1IU(Amplicor)=89.3IU(Versant)=86.2IU(TaqMan)

=5X10-4MEq=2.7Log10copiesHBVDNA1000copies=190IU(Amplicor)=179

IU(Versant)=172IU(TaqMan)

=1X10-3MEq=3.0Log10copies

HBVDNA检测下限国产500～1000copies进口50～

200copiesHCVRNA检测下限国产1000～2000copies进口100copiesHBVDNA检测方法⒈杂交

⒉定性PCR（基本淘汰）

⒊定量PCR（主流）⒋基因芯片（将来？）HBVDNA检测方法的比较

斑点杂交PCR定量PCR敏感性105102102特异性高稍低高重复性好稍差好定量范围466简便较繁琐简便简便安全性好好好设备便宜稍贵昂贵技术要求低高高检测价格低中高基因芯片

阳性参照荧光信号值大于35000，探针10位置处的荧光信号值为3378、3228，探针14位置处的荧光信号值为12643、11498，探针16位置处的荧光信号值为16278、16595，探针17位置处的荧光信号值为52009、53246，探针18位置处的荧光信号值为3876、4550，阴性对照荧光信号值均小于400，空白对照处荧光信号值小于50。此反应区的结果判读为HBVDNA(+)、HCVRNA(+)、YVDD变异和HCV1b＋3b型。芯片扫描结果芯片信号强度和HBVDNA定量检测结果的比较血清编号芯片信号平均值定量检测结果81039851018518686618865608679981212810018076581668818238306683072830768475285149825538242682938829391811024069174861777121725230221461111759164371615415195131731607312899104301348287958369878183691.01×1092.97×1091.08×1091.35×1091.42×1091.73×1093.82×1071.68×1075.96×1073.28×1073.24×1072.97×1074.38×1071.90×1072.30×1073.19×1075.07×1052.46×1056.24×1053.79×105

基因芯片与HBVDNA定量检测HBV结果比较基因芯片阳性阴性

阳性194HBVDNA定量阴性215符合率为85%(34/40)，芯片检出率为82.61%(19/23),假阳性率为11.76%(2/17).

芯片检测HBVYMDD变异株与测序法检测结果的比较标本编号基因芯片法DNA测序法1234567891011121314151617181920YVDDYMDDYVDDYVDDYVDD+YIDDYIDDYMDDYMDD+YVDD+YIDDYVDDYVDDYVDD+YIDD未检出YVDDYVDDYVDDYVDDYMDDYIDDYVDD+YIDDYVDDYVDDYMDDYVDDYVDDYVDDYIDDYMDDYMDDYVDDYVDDYIDDATG→ATAYVDDYVDDYVDDYVDDYMDDYIDDYVDDYVDD

基因芯片与错配PCR检测YMDD变异株结果比较基因芯片阴性YMDDYVDDYIDD混合

错阴性

30000配YMDD1

3

11

2PCRYVDD12

5

00YIDD00001混合00000

5份芯片检测的标本与DNA序列测定结果一致

我科1474例HBV-M与HBVDNA结果分析

HBsAgHBeAgHBcAbHBsAbHBeAb例数HBVDNA(+)

例数(%)1+++--603520（86.2）2+-+-+465163（35.1）3++---1918（94.2）4+-+--21688（40.7）5+---+53（60）6--+++201（5）7--++-271（3.7）8--+-+242（8.0）9---++10（0）10---+-562（3.6）11--+--263（11.5）12++++-22（100）13-----100（0）合计1474803

注：数据引自陈雪娟论文乙型肝炎组织中HBV标志物的检测可用免疫组织化学方法检测肝组织中HBsAg、HBcAg的存在及分布；原位杂交或原位PCR方法检测组织中HBVDNA的存在及分布。除可判定病毒是否处于复制状态外，对血清中HBV标志物阴性病人的诊断有一定意义。HBV基因型的检测

PCR(SNP,RFLP

)

序列测定

基因芯片耐药的位置和检测LVD:M204I/VADV:N236T和/或A181VETV：(1)M250V或I169T或S202I/G或T184G/A/I/S(2)M204VI+(1)L-dT:M204I/V拉米夫定恩替卡韦替比夫定阿德福韦V173LL180MA181VA184GS202IM204IM204VN236TM250VYangetalHepatology2003;38:705ALaietalHepatology2003;38:262AColonnoetal43rdICAAC;Abst#V-786LeungetalHepatology2001;34:349A耐药变异株检测方法核苷酸序列测定法(PCR产物直接测序)(准种池20%)聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)5%实时PCR(real-timePCR)10%聚合酶链反应微板核酸杂交-酶联免疫黏附法(PCR-ELISA)基因芯片技术(microarray)反向杂交法(INNO-LiPA)5%-10%基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOFMS)1%

芯片检测HBVYMDD变异株与测序法检测结果的比较标本编号基因芯片法DNA测序法1234567891011121314151617181920YVDDYMDDYVDDYVDDYVDD+YIDDYIDDYMDDYMDD+YVDD+YIDDYVDDYVDDYVDD+YIDD未检出YVDDYVDDYVDDYVDDYMDDYIDDYVDD+YIDDYVDDYVDDYMDDYVDDYVDDYVDDYIDDYMDDYMDDYVDDYVDDYIDDATG→ATAYVDDYVDDYVDDYV