仪器分析-药物定量分析与分析方法验证

第四章药物定量分析与分析方法验证第一节定量分析样品的前处理方法

不经有机破坏:

直接测定法(富马酸亚铁的含量测定)经水解后测定法(硬脂酸镁的含量测定)经氧化还原后测定(泛影酸的含量测定)需经有机破坏：

湿法破坏干法破坏氧瓶燃烧法定量分析样品的前处理方法---不经有机破坏

直接测定法

适用于金属原子不直接与碳原子相连的含金属药物或金属原子与碳原子结合不牢固的有机金属药物。如富马酸亚铁的含量测定。结构式如下：经水解后测定法1）直接回流后测定法（如三氯叔丁醇）原理三氯叔丁醇在氢氧化钠溶液中加热回流水解，氯元素全部转变成氯化钠，然后用剩余滴定法，即于水解液中加硝酸酸化，再加入定量过量的硝酸银滴定液，使Cl-生成AgCl沉淀，过量的硝酸银，以Fe3+为指示剂，用硫氰酸铵溶液回滴定。2）用硫酸水解后测定法（如硬脂酸镁---指示剂?）定量分析样品的前处理方法---不经有机破坏

经氧化还原后测定

1）碱性还原后测定（如泛影酸---指示剂曙红钠）本法适用于测定结构中碘与苯环直接相连，且一个苯环上含多个碘原子的含卤素有机药物。定量分析样品的前处理方法---不经有机破坏

2）酸性还原后测定（如碘番酸---指示剂四溴酚酞）定量分析样品的前处理方法---不经有机破坏

3）利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量 葡萄糖酸锑钠的测定-淀粉指示剂ChP2005）定量分析样品的前处理方法---不经有机定量分析样品的前处理方法---需经有机破坏湿法破坏硝酸-高氯酸法：适用于生物样品的破坏；不适用于含氮杂环药物的破坏硝酸-硫酸法：适用于多数有机药物的破坏；不适用于含碱土金属有机药物的破坏硫酸-硫酸钾法：适用于含砷或锑有机药物的破坏硝酸-硫酸-高氯酸法等

干法破坏适用于湿法不易破坏完全的有机物及不能用硫酸破坏的；不适用于含易挥发性金属有机药物。氧瓶燃烧法本法特点是设备简单，快速分解、破坏完全，尤其适用于微量样品的分析定量分析样品的前处理方法---需经有机破坏氧瓶燃烧法原理氧瓶燃烧法：将有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或含量测定适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析 仪器装置 称样要求 具体操作 吸收液的作用:是将样品经燃烧分解所产生的各种价态的卤素、硫、氮、硒等，定量地吸收并转变为一定的便于测定的价态吸收液的选择

氟水

氯NaOH溶液溴H2O2-NaOHNaOH-硫酸肼饱和溶液碘NaOH－硫酸肼饱和溶液硫NaOH或H2O2

硒硝酸溶液注意事项①根据被燃烧分解的样品量选用适宜大小的燃烧瓶---ChP（2005）规定的燃烧瓶体积为500、1000或2000ml三种，采用常量或半微量分析②测定含氟有机药物时，用石英制燃烧瓶 ③铂丝燃烧时起催化作用 ④应同时做空白试验 ⑤燃烧时要注意防爆⑥燃烧要完全⑦燃烧产生的烟雾完全被吸收第二节定量分析方法的特点容量分析法光谱分析法色谱分析法一、容量分析法1.概念容量分析法是将已知浓度的滴定液由滴定管滴加到待测药物的溶液中，直到所加滴定液与被测药物按化学计量反应完全为止，然后根据滴定液的浓度和消耗的体积，就可以计算出被测药物的含量。

2、容量分析法的特点需要重量分析中沉淀的过滤、洗涤、灼烧、恒重等一系列操作。通常用于测定高含量或中含量组分，即被测组分的含量在1%以上。

比较准确，一般情况下相对误差可达0.2%以下。所用仪器普通易得。3、容量分析法----需注意的问题滴定误差

滴定终点与等当点不一定恰好符合，二者之间存在误差

。需要选择合适的指示剂，使滴定终点尽可能接近等当点。

4、容量分析法----计算滴定度

指每1ml某摩尔浓度的滴定液所相当的被测药物的重量。中国药典用毫克(mg)表示。如：用碘量法测定维生素C含量时，规定“每1ml的碘滴定液(0.1mol／L)相当于8.806mg的维生素C”；

容量分析法----滴定度（T） 被测药物(B)与滴定液(A)之间按一定的摩尔比进行反应：aA+bB

cC+dD滴定度(T)可按下式计算：T=M*b/a*B(mg／ml)M：滴定液的摩尔浓度b：被测药物的摩尔数a：滴定液的摩尔数B：被测药物的分子量

容量分析法---百分含量计算直接滴定法用滴定液直接滴定，以求得被测药物的含量。回滴定法(剩余滴定法)

先加入定量过量的滴定液A，使其与被测药物反应，待此反应进行完全后，再用另一滴定液B来回滴反应中剩余的滴定液A。

直接滴定法含量%=V*T/W*l00％W：供试品取量V：消耗滴定液的体积T：滴定度 实际工作中，所配制的的滴定液的摩尔浓度与药典中规定的摩尔浓度不一定恰好符合，此时就不能直接应用药典上所给出的滴定度(T)，但可换算成实际的滴定度(T')：T'=T*F F（校正因数）=实际摩尔浓度/规定摩尔浓度被测药物的百分含量可由下式求得：回滴定法不做空白试验时百分含量计算：VA：先加入的定量过量的滴定液A体积VB：为滴定液B消耗体积FA：滴定液A浓度校正因数FB：滴定液B浓度校正因数W：供试品取量T：滴定度。

做空白试验时百分含量计算：V0：空白试验消耗硫酸滴定液体积VB：样品测定试验消耗滴定液体积T：滴定度F：为滴定液浓度校正因数W：供试品取样量(g)

二、光谱分析法 当物质与辐射能相互作用时，物质内部发生能级跃迁。记录由能级跃迁所产生的辐射能随波长的变化所得的图谱称为光谱，利用物质的光谱进行定性、定量和结构分析的方法称为光谱分析法，简称光谱法。紫外—可见分光光度法荧光分析法原子吸收分光光度法红外分光光度法

紫外可见分光光度法 根据物质分子对波长为200nm~760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的光谱分析方法。原理：朗伯-比耳定律 灵敏度高，可达10-4g／ml~10-7g／ml.

准确度高，相对误差为2％~5％。仪器价格较低廉，操作简单；易于普及。应用广泛。(许多化合物都可以采用此法进行测定，应用计算分光光度法可不经分离而直接测定混合物中各组分的含量。)紫外可见分光光度法原理朗伯-比耳定律可表示如下：A=E*C*lA：吸收度；l：液层厚度；C：溶液浓度；E：吸收系数，即单位浓度、单位液层厚度时的吸收度。

紫外可见分光光度法吸收系数摩尔吸收系数（ε）：在一定波长下，溶液浓度为1mol／L，厚度为1cm时的吸收度，多用于研究分子结构。百分吸收系数（）：在一定波长下，溶液浓度为1%(W／V)，厚度为1cm时的吸收度，多用于定量测定。两者之间的关系为=ε*10/M

M：吸光物质的分子量(即摩尔质量)

紫外可见分光光度法吸收系数ε值的大小反映了物质对某一波长光的吸收能力，也反映测定反应的灵敏度。ε一般不超过105数量级，通常ε达104的为强吸收；102~104为中吸收；小于102的为弱吸收。吸收系数都不能直接测得，而必须采用适宜的已知准确浓度的稀溶液测得吸收度A后计算求得。

紫外可见分光光度法仪器校正和检定 由于温度变化对机械部分的影响，仪器的波长经常会略有变动。定期对所用仪器进行全面校正检定测定前校正测定波长。

常用汞灯中的较强谱线或用仪器中氘灯的谱线进行校正。吸收度的准确度

可用重铬酸钾的硫酸溶液检定。

紫外可见分光光度法对溶剂的要求

测定供试品之前，应先检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求，即用1cm石英吸收池盛溶剂，以空气为空白（即光路中不置任何物质）测定其吸收度，溶剂和吸收池的吸收度220nm~240nm：不得超过0.40；

24lnm~250nm：不得超过0.20；251nm~300nm：不得超过0.10；300nm以上：不得超过0.05。

紫外可见分光光度法测定法

以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照，采用1cm的石英吸收池，在规定的吸收峰波长±2nm以内测试几个点的吸收度，以核对供试品的吸收峰波长位置是否正确。吸收峰波长应在该品种项下规定的波长士1nm以内；否则应考虑试样的真伪，纯度以及仪器波长的准确度，并以吸收度最大的波长作为测定波长。一般供试品溶液的吸收度读数，以在0.3-0.7之间的误差较小。由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，所以测定供试品溶液的吸收度后应减去空白读数，再计算含量。

紫外可见分光光度法含量测定方法对照品比较法

吸收系数法

计算分光光度法

紫外可见分光光度法含量测定方法

对照品比较法

分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的100±10%，所用溶剂也应完全一致，在规定的波长测定供试品溶液和对照品溶液的吸收度后计算。

Cx：供试品溶液的浓度；Ax：供试品溶液的吸收度；Cr：对照品溶液的浓度；Ar：对照品溶液的吸收度；D：稀释倍数；W：供试品取样量。

紫外可见分光光度法含量测定方法

吸收系数法 配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸收度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。

用本法测定时，应注意仪器的校正和检定。

紫外可见分光光度法含量测定方法

计算分光光度法

采用计算分光光度法应慎重。方法有多种，使用时均应按各品种项下规定的方法进行。当吸收度处在吸收曲线的陡然上升或下降的部位测定时，影响精度的因素较多，故对照品和供试品测试条件应尽可能一致。若测定时不用对照品，如维生素A测定法，则应在测定时对仪器作仔细地校正和检定。

荧光分析法 某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的荧光。当激发光停止照射后，荧光随之消失。同一种分子结构的物质，用同一波长的激发光照射，可以发射相同波长的荧光。当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其荧光强度(也叫发射光强度)与溶液中该物质的浓度成正比关系，可以用作定量分析。

荧光分析法的特点灵敏度高，可达10-10g／ml~10-12g/ml荧光分析法应在低浓度溶液中进行。干扰因素也多，因此必须做空白试验。对易被光分解的样品，可选择一种激发光和发射光波长与之近似而对光稳定的物质配成适当浓度的溶液作为基准溶液代替对照品溶液校正仪器的灵敏度。荧光衍生试剂可扩大荧光分析法的应用范围。取样少，方法快速。

荧光分析法的含量测定方法 由于不易测定绝对荧光强度，故荧光分析法都是在一定条件下，用对照品溶液测定荧光强度与浓度的线性范围后，再在每次测定前，用一定浓度的对照品溶液校正仪器的灵敏度；然后在相同条件下，读取对照品溶液及其试剂空白的荧光读数与供试品溶液及其试剂空白的荧光读数计算供试品浓度。

荧光分析法的含量测定的计算Ci：供试品溶液浓度；Cr：对照品溶液浓度；Ri：供试品溶液读数；Rib：供试品溶液试剂空白的读数；Rr：对照品溶液的读数；Rrb：对照品溶液试剂空白的读数

*因荧光分析法中的浓度与读数的线性较窄，故(Ri-Rib)／(Rr-Rrb)应在0.50~2.0之间，如有超过，应在调节溶液浓度后再测。

三、色谱分析法

色谱分析法是一种分离分析方法，它先将各组分从混合物中分离再逐个分析，因此是分析混合物的最有力手段。此法具有高灵敏度(可达10-12g／ml~10-15g/ml)、高选择性、高效能、高速度及应用广泛等特点。

根据其分离原理可分为： 吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱等。根据分离方法分为： 纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。1、色谱分析法---高效液相色谱法

用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。

高效液相色谱法一般要求常用的色谱柱填充剂：硅胶和化学键合硅胶(十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶、氰基或氨基键合硅胶）离子交换填充剂：用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂：用于分子排阻色谱等。进样量：一般为数微升。

除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。

流动相：常以甲醇、水、乙腈、缓冲液、反离子物质等。

高效液相色谱法一般要求流动相及供试品溶液：应澄清，要求用滤器过滤后使用或进样。如果流动相中有缓冲剂，每日使用后应用不含缓冲剂的流动相将仪器管路、泵、进样阀、色谱柱、检测池等充分冲洗。色谱柱保存：应保持填料在湿润状态，两端密塞，可按说明书要求保存。十八烷基硅烷键合硅胶可在甲醇中保存，硅胶可在己烷中保存。

高效液相色谱法一般要求色谱柱型号选用及注意：色谱柱长度不能决定分离效果，较好的填料用短柱即可；流动相流速应取决于柱内径及柱效；由于柱效及柱子性能不同，流动相各组分比例需调整；在用十八烷基硅烷键合相色谱柱时，色谱峰如果保留时间太长可增加甲醇比例，使其前移，反之可使之后移。如果柱效略嫌低，可以适当提高色谱柱柱温。

高效液相色谱法----系统适用性试验用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。

高效液相色谱法----系统适用性试验色谱柱的理论板数(n)：在选定条件下，注入供试品溶液或规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间（tR）和半峰高宽(Wh/2)

n=5.54(tR／Wh/2)2如测得理论板数低于规定的最小理论板数，应改变色谱柱的条件(如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等)，使理论板数达到要求。

高效液相色谱法----系统适用性试验分离度：定量分析时：为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度，分离度(R)的计算公式为：tR1：相邻两峰中后一峰的保留时间；tR2：相邻两峰中前一峰的保留时间；Wl及W2：此相邻两峰的峰宽；*除另有规定外，分离度应大于1.5。

高效液相色谱法----系统适用性试验重复性：取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值均相对标准偏差应不大于2.0％。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80％、10