内质网应激 申宗侯

内质网应激生化与分子生物学教研室申宗侯

内质网是真核细胞中的细胞器，它参与膜蛋白及分泌蛋白质和胆固醇及其他脂类的合成，也是细胞内钙离子贮存库。20世纪70年代开始发现了许多干扰内质网功能的因素可直接或间接使内质网中未折叠的蛋白质堆积，使细胞处于应激状态（ERstress），细胞通过未折叠蛋白质反应（unfoldedproteinresponse,UPR）来适应内质网应激。未折叠蛋白质反应途径（UPRpathway）是一种信号转导途径，最早在酵母中阐明。近年来对哺乳动物细胞未折叠蛋白质反应途径的研究也获得了重要成果。由于强烈的内质网应激导致细胞凋亡，并且许多人类疾病中也存在细胞内质网应激，因此对内质网应激的基础理论研究不仅能阐明其机制，而且对与内质网相关疾病的防、治研究也有指导作用第一节干扰内质网功能的因素可导致内质网应激诱导未折叠蛋白质反应内质网的两大主要功能

内质网是真核细胞的细胞器，它是内质网膜构成的网状管道。内质网膜中镶嵌着各种膜蛋白，内质网腔中也有各种蛋白质，它们与内质网的功能密切相关。内质网有以下两大主要功能：（一）内质网参与膜蛋白和分泌蛋白质的合成并且是新生肽链折叠、糖基化修饰、亚基组装和蛋白质质量控制的场所蛋白质的合成场所是多聚核糖体，即一条mRNA上结合着许多翻译进程不同的核糖体，从mRNA的5’端向3’端核糖体上新生肽链的长度逐渐增加。膜蛋白或分泌蛋白的新生肽链的N端是信号肽，信号肽合成后由胞质中的信号识别颗粒（signalrecognitionparticle）介导，使多聚核糖体附着在内质网膜上。信号肽通过内质网膜上的易位子（translocon）,一种中间有孔道的膜蛋白，进入内质网腔，并且引导后续肽链的进入。信号肽完成功能后被内质网中的信号肽酶切除。新生肽链在内质网腔中由各种伴侣蛋白辅助进行折叠，由一系列酶的催化在糖基化位点进行糖基化修饰。寡聚蛋白质的组装也在内质网腔中进行。只有正确折叠合组装的蛋白质才有生物学功能，并被分拣、投送到高尔基体、溶酶体、细胞膜或者分泌到细胞外。（图9-1）易位子复合物核糖体新生蛋白质肽链图9-1膜蛋白与分泌蛋白的合成、分拣与投送伴侣蛋白（chaperoneorchaperon）是一大类在细胞内广泛分布，存在于细胞核、细胞质及各细胞器，能与非天然构象的蛋白质相互作用，例如，它们能和内质网内合成之中的肽链结合，介导各结构域（domain）乃至整个蛋白质分子的正确折叠；它们能与胞质中合成的线粒体蛋白质结合，使其肽链保持伸展状态而被转运到线粒体的各个空间；热休克（heatshock）使细胞内蛋白质变性时，它们能与这些蛋白质结合，稳定其结构，预防蛋白质变性后内部疏水基团暴露而发生蛋白质分子间不可逆的聚集。内质网中的重要的伴侣蛋白有①免疫球蛋白重链结合蛋白（Bip,又称葡萄糖调节蛋白78，GRP78）：它能与新生肽链的疏水基团结合，辅助它正确折叠，使疏水基团包埋在蛋白质分子内部。②钙联蛋白（calnexin）和钙网蛋白（calreticulin）：糖蛋白肽链的正确折叠与N糖基化密切相关，内质网中合成的核心N糖链中最初含有葡萄糖基。介导它们肽链折叠的活性依赖于钙离子的钙联蛋白和钙网蛋白能识别并结合含有葡萄糖基核心N糖链，并使这些葡萄糖基被葡萄糖苷酶切除，肽链才能折叠。若折叠不正确，葡萄糖基转移酶能在核心N糖链添加葡萄糖基，上述伴侣蛋白又能重新介导葡萄糖基的切除及肽链的折叠。正确折叠的糖蛋白中核心N糖链不会再被糖基化（图9-2）。③肽基脯氨酰异构酶和二硫键异构酶：它们分别催化肽链中脯氨酰残基的顺反异构和二硫键异构，使肽链形成天然构象和热力学稳定的二硫键。伴侣蛋白在辅助肽链折叠时需ATP。内质网腔中的环境，如钙离子浓度和氧化还原状态（还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比值）有利于肽链的折叠，并且又有多种伴侣蛋白的辅助，新生肽链能够正确折叠，但是不能避免肽链折叠的错误或者蛋白质组装不完全。偶尔产生的“次品”不会被分拣、投送或分泌，而是被内质网的转运蛋白识别，将它们转运到胞质，在胞质中多泛素化（polyubiquitination）后被蛋白酶体（proteasome或proteosome）降解。这一过程称为内质网相关的蛋白质降解（ERassociatedproteindegradation，ERAD），是内质网对蛋白质的质量控制（qualitycontrol，QC）。N-糖链葡萄糖苷酶Ⅰ和Ⅱ钙网蛋白UDP-葡萄糖-糖蛋白糖基转移酶α1、2甘露糖苷酶Ⅰ内质网促降解1、2甘露糖苷酶样蛋白图9-2钙网蛋白介导糖蛋白折叠过程（二）内质网是细胞内的钙离子贮存库内质网腔中钙离子浓度是胞质钙离子浓度的数十倍。两者之间极大的浓度差是信号转导途径中钙离子从内质网释放入胞质作为信使的基础。例如当胞外信号分子与相应的膜受体结合，活化磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C（PI-PLC），PI-PLC分解细胞膜中的磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2），产生二脂酰甘油（DG）和肌醇三磷酸（IP3），它们都是第二信使。IP3能与内质网膜上的特异受体结合，使钙离子通道开放，内质网中贮存的钙离子进入胞质，胞质中钙离子浓度升高。钙离子和DG一起活化蛋白激酶C（PKC）；钙离子又能与钙调蛋白（calmodulin，CaM）结合，Ca2+-CaM活化CaM依赖性蛋白激酶（CaM-PK）。PKC和CaM-PK的活化能调节细胞内相关酶的活性和基因转录，产生相关效应。因此有文献认为钙离子是细胞内第三信使。在完成信使功能之后，钙离子被内质网膜的Ca2+-ATP酶重新泵入内质网贮存。二内质网应激导致未折叠蛋白质反应

（一）

许多因素可使内质网中未折叠蛋白质堆积许多环境因素或细胞内因素，如低氧、葡萄糖或氨基酸等营养物质不足，肽链在内质网中折叠受阻，内质网中分泌蛋白质超负荷，病毒感染、基因突变、内质网与胞质间钙离子浓度差失调等，都有可能导致细胞内质网应激。这些因素中有些对细胞的影响相当广泛，另一些则比较局限，但它们都可以干扰内质网的功能，直接或间接使内质网中非折叠蛋白质堆积，细胞处于应激状态，称内质网应激（表9-1）表9-1导致ERstress的因素及其作用机制因素作用机制葡萄糖不足能源不足，糖基化原料不足，蛋白质折叠受阻衣霉素（tunicamycin）抑制内质网中N糖链合成，糖蛋白折叠受阻二巯基苏糖醇（DTT）打开二硫键，蛋白折叠受阻

抑制内质网Ca2+ATP酶，干扰内质网贮存钙离子功能，抑制蛋白折叠基因突变可表达结构异常的蛋白质，结构异常的蛋白可在内质网堆积病毒感染病毒RNA活化蛋白激酶PKR，病毒蛋白可与宿主蛋白相互作用，可以导致未折叠蛋白质反应thapsigargin（二）细胞对未折叠蛋白质的堆积作出应答－非折叠蛋白质反应堆积在内质网中的未折叠蛋白质或错误折叠的蛋白质作为信号，活化内质网膜上的相关受体，从而活化相关的蛋白激酶或经过信号转导，信号传递到细胞核，调节相关基因表达，产生效应，称未折叠蛋白质反应。效应分三方面：①上调伴侣基因蛋白表达，从而加强中未折叠蛋白质的折叠。②抑制蛋白质生物合成，以减少内质网中需要折叠蛋白质的来源。③促进ERAD。加强未折叠或错误折叠蛋白质转运出内质网并在蛋白酶体中降解。三大效应能增强内质网的功能和减轻内质网的负荷，细胞通过它们适应ERstress。若作用因素强烈，细胞UPR不能克服高强度的ERstress，就会凋亡。第二节

UPR途径首先在酵母中阐明一、UPR最初在哺乳动物中发现20世纪70年代发现RNA肿瘤病毒感染哺乳动物细胞能诱导P78和P94蛋白质的表达，并证明了肿瘤病毒感染细胞后细胞恶性变，增殖加速，导致培养基中葡萄糖供不应求是这两种蛋白质表达的原因，因此将它们命名为葡萄糖调节蛋白P78和P94。以后又发现了其他影响内质网内环境的因素也能上调这些蛋白的表达。80年代初发现了一种内质网中的蛋白质，它能与未装配或免疫球蛋白的重链结合，并抑制重链分泌，因此将它命名为Bip，并发现Bip与GRP78是同一种蛋白，它不仅与免疫球蛋白重链结合，还可以与其他为折叠的蛋白质结合。它是第一个被发现的内质网中的伴侣蛋白。学者们将Bip两方面的研究结果结合起来，提出了葡萄糖供应不足及影响内质网内环境的因素上调Bip/GRP78表达与内质网中的折叠密切相关，可能是由于未折叠蛋白质的堆积作为信号，上调Bip/GRP78表达，以加强内质网中蛋白质的折叠。20世纪90年代通过实验证明了这一假说：只要过量表达由于基因突变而不能折叠得流感血凝蛋白（HA）就足以上调Bip/GRP78和GRP94的表达，于是提出了ＵＰＲ。与此同时克隆了Bip/GRP78和GRP94基因的启动子，通过对比找到了调节它们表达的顺式作用元件，但是由于哺乳动物基因表达调控和信号转导途径的复杂性，要进一步阐明ＵＰＲ信号途径遇到了困难。因此尽管ＵＰＲ最初在哺乳动物中发现，但仅仅找到了途径上游的信号；未折叠蛋白质在内质网中的堆积和下游的效应，上调内质网中伴侣蛋白的表达，中间过程完全不明。二、酵母的UPR途径比哺乳动物细胞简单完整的UPR途径首先在酵母中阐明。20世纪90年代初在酵母Bip基因启动子中发现了22bp的顺式作用元件UPRE，将它组装在报告基因中后，引起ERstress的因素可诱导报告基因的表达。研究酵母UPR途径的工作从两方面开展：①用分子遗传学方法在ERstress因素作用后不能诱导Bip表达的突变株中找到了Ire1p（又称Ern1p）基因。野生型的Ire1p在ERstress因素作用下诱导Bip及其他内质网伴侣蛋白的表达，产生UPR。Ire1p是内质网的单跨膜蛋白，N端位于内质网腔，C端位于胞质，其中有丝／苏氨酸蛋白激酶域和RNase域。由于其结构与单跨膜受体蛋白结构很相似，因此推测它的Ｎ端能感觉内质网中未折叠蛋白质堆积的信号，从而分子变构、寡聚化、C端的蛋白激酶域活化、使寡聚化的Ire1p相互磷酸化，但C端的RNase域功能未明。②用分子生物学方法寻找与UPRE相互作用的转录因子，结果找到了HAC1蛋白，分子中有碱性亮氨酸拉链域（bZIP），能结合UPRE，使报告基因表达。经研究HAC1mRNA也存在于未发生ERstress的细胞中，但HAC1mRNA要经过剪接，去除中间一段252核苷酸的内含子后才能被翻译，表达出HAC1蛋白。HAC1mRNA剪接并非通过经典的剪接体途径，而是依赖于Ire1p蛋白C端的RNase切除内含子，由Rlg1p蛋白（一种tRNA连接酶）将外显子连接。于是阐明了酵母中的UPR途径：内质网中的Bip与Ire1蛋白的Ｎ端以非共价方式结合，抑制Ire1蛋白的活化。内质网中堆积的未折叠蛋白质能与Bip相互作用，使Bip脱离Ire1蛋白，因而Ire1蛋白活化（包括变构、寡聚化、相互磷酸化而使RNase活化）。RNase切除HAC1mRNA中内含子，Rlg1p连接外显子。剪接后的HAC1mRNA表达出HAC1蛋白，HAC1蛋白与顺式作用元件UPRE结合，活化内质网中伴侣蛋白基因表达。第三节哺乳动物细胞ERstress活化三条信号转导途径一、类似于酵母的UPR途径酵母中UPR途径的阐明促进了哺乳动物细胞UPR的研究。20世纪90年代末发现了哺乳动物细胞中存在两种与酵母Ire1的蛋白质。Ire1α广泛分布于各种细胞内质网膜，Ire1β分布于肠黏膜细胞内质网膜。它们的N端位于内质网腔，C端位于胞质，其中有丝苏氨酸激酶域和RNase域。它们的功能与酵母Ire1相同：引起ERstress的因素能使它们寡聚化、相互磷酸化，产生UPR。它们的显性负突变体能阻断上述功能。体外实