食品微生物检验常用的试剂及其配制-染料及染色液的配制

常用染色液的配制目录/Contents1常用染色液的配制染色液01常用染色液的配制1.吕氏碱性美蓝染色液美蓝0.3g95％乙醇30mL0.01％氢氧化钾溶液100mL将美蓝溶解于乙醇中，然后于氢氧化钾溶液混合。染色时，先将涂片在火焰上固定，待冷却后滴加染液，染1min~3min，水洗，待干，镜检。01常用染色液的配制2.奥尔特氏荚膜染色液（1）成分沙黄3g蒸馏水100mL用乳钵研磨溶解。01常用染色液的配制（2）染色法将涂片在火焰上固定，滴加染色液，并加热至产生蒸汽后，继续染3min，水洗，待干，镜检。（3）结果炭疽芽孢杆菌菌体呈赤褐色，荚膜呈黄色。01常用染色液的配制3.瑞氏染色液（2015年新法）（1）成分瑞氏色素0.1g甲醇60mL用乳钵研磨溶解01常用染色液的配制3.瑞氏染色液（2015年新法）（2）染色法①待涂片自然干燥后，滴加染色液，固定1min。②加入等量磷酸盐缓冲液，轻轻晃动玻片或采用其他方式混合，使磷酸盐缓冲液与瑞氏染液混匀静置；③再用蒸馏水从一端轻轻冲洗，待干燥后，镜检。01常用染色液的配制4.革兰氏染色法（1）染色液①结晶紫染色液结晶紫1g95％乙醇20mL1％草酸铵水溶液80mL将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。01常用染色液的配制②革兰氏碘液碘1g碘化钾2g蒸馏水300mL将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，在加蒸馏水至300mL。01常用染色液的配制③沙黄复染法染色液沙黄0.25g95％乙醇10mL蒸馏水90mL将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。01常用染色液的配制（2）染色法①将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗；②滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；③滴加95％乙醇脱色，约30s；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s；④水洗，滴加复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。（3）结果革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。01常用染色液的配制5.耐酸性染色法（1）染色液①石炭酸品红染色液碱性品红0.3g95％乙醇10mL5％苯酚水溶液90mL将品红溶解于乙醇中，然后与苯酚溶液混合。01常用染色液的配制②3％盐酸-乙醇浓烟酸3mL95％乙醇97mL③复染液吕氏碱性美蓝染色液01常用染色液的配制（2）染色法①将涂片在火焰上固定，滴加石炭酸品红染色液，徐徐加热至有蒸汽出现，但切不可使沸腾。染液因蒸发减少时，应随时添加。染5min，倾去染液，水洗；②滴加盐酸-乙醇脱色，直至无红色脱落为止，（所需时间视涂片厚薄而定，一般为1min~3min），水洗；③加吕氏碱性美蓝染色液，复染30min，水洗，待干，镜检。（3）结果耐酸性细菌呈红色，其他细菌、细胞等物质呈蓝色。01常用染色液的配制6.柯氏染色法（1）染色液成分0.5％沙黄液0.5％孔雀绿液（2）染色法①将涂片在火焰上固定，滴加0.5％沙黄液，并加热至出现气泡，约2min~3min，水洗；②滴加0.5％孔雀绿液，复染40s~50s，水洗，待干，镜检。（3）结果布氏杆菌呈红色，其他细菌及细胞呈绿色。01常用染色液的配制7.鞭毛染色法（1）染色液的配制①甲液称丹宁酸5g、氯化高铁（FeCl3）1.5g，溶于100mL蒸馏水中，待溶解后加入1％的氢氧化纳溶液1mL和15％的甲醛溶液2mL。01常用染色液的配制7.鞭毛染色法②乙液称2g硝酸银溶于100mL蒸馏水中。在90mL乙液中滴加浓氢氧化铵溶液，到出现沉淀后，继续滴加使其变为澄清，然后用其余10mL乙液小心滴加至澄清液中，至出现轻微雾状为止（此为关键性操作，应特别小心）。滴加氢氧化铵和用剩余乙液回滴时，要边滴边充分摇荡，染液当天配，当天使用，2d~3d后基本无效。01常用染色液的配制（2）染色法在风干的载玻片上滴加甲液，4min~6min后，用蒸馏水轻轻冲净，再加乙液，缓缓加热至冒汽，维持约半分钟（加热时注意勿出现干燥面），在菌体多的部位可呈深褐色到黑色，停止加热，用水冲净，干后镜检。菌体及鞭毛为深褐色到黑色。01常用染色液的配制8．考马斯亮蓝R-250染色液考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质―染料结合的原理,定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。01常用染色液的配制8．考马斯亮蓝R-250染色液考马斯亮蓝R-250染色液的配置方法（1L的量）：（1）称取1g考马斯亮蓝R-250，置于1L烧杯中。（2）量取250mL的异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解。（3）加入100mL的冰乙醋酸，均匀搅拌。（4）加入650mL的去离子水，均匀搅拌。（5）用滤纸出去颗粒物质后，室温保存。染色与细菌的形态观察技术目录/Contents1染色的基本程序染色第一节染色与细菌的形态观察技术媒染染色固定干燥涂片脱色复染染色的基本程序01染色的基本程序1.载玻片处理（1）滴上95％酒精2～3滴，用清洁纱布擦拭，然后以钟摆速度通过酒精灯焰3～4次。（2）若上法仍未能除去油渍，可再滴上1～2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻拖过。玻片洁净后，用玻璃铅笔在预涂材料处的背面划一个直径1.5cm的圆圈，用以标记。01染色的基本程序2．涂片方法（1）菌落涂片方法涂片时，左手握菌种管，右手持接种环（又称铂金耳）取1～2环生理盐水，置于载玻片上，然后将接种环在火焰上灭菌，待冷后，从菌种管内钓取少许菌落，置于生理盐水中混匀，涂成直径1.5cm的涂膜，此膜既薄又均匀为好，待干即成。（2）菌液涂片法用灭菌接种环沾取菌液（液体培养物、血清、乳汁、组织渗出液等）1～2接种环，均匀涂抹在载玻片上,使成直径为1.5cm左右圆形或椭圆形涂膜，自然干燥后备用。01染色的基本程序2．涂片方法（3）血液涂片方法先取一张干净无油垢边缘整齐的载玻片，其一端沾取少许血液，以45度角放在另一张干净无油垢的载玻片一端，从这端向另一端推成薄而均匀的血膜，待干后备用。（4）组织涂片方法先用镊子夹持组织局部，然后以灭菌剪刀剪取一小块，夹出后以其新鲜切面在载玻片上压印或涂成一薄层。01染色的基本程序3.干燥涂片最好在室温中自然干燥。必要时，可将标本面向上，在离酒精灯火焰远处烘干，切勿紧靠火焰，以免标本糊焦而不能检查。01染色的基本程序4．固定有两种固定方法：（1）火焰固定将已干燥好的抹片，使涂面向上，以钟摆速度通过酒精灯火焰四次，使固定后的标本触及皮肤时，稍感烧烫为度。放置冷却后，进行染色。（2）化学固定血液、组织脏器等抹片作姬姆萨氏染色或单染色时，不用火焰固定而用甲醇固定，可将已干燥的抹片浸入甲醇中2～3min，取出晾干；或者在抹片上滴加数滴甲醇使其作用2～3min后，自然挥发干燥，抹片作瑞特氏染色时则不必作特别固定，染色液中含有甲醇可以达到固定目的。01染色的基本程序5．染色根据检验目的不同，选择不同的染色方法进行染色。染色时滴加染液，以覆盖标本为度。01染色的基本程序6．媒染凡能增强染料和被染物的亲和力，使染料固定于被染物及能引起细胞膜通透性改变的物质，称媒染剂。常用的有明矾、鞣酸、金属盐和碘等，也有用加热法促进着色。媒染剂可用于初染与复染之间，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。01染色的基本程序7．脱色

凡能使已着色的被染物脱去颜色的化学试剂称为脱色剂。常用乙醇、丙酮等作为脱色剂。脱色剂可以查出细菌与染料结合的稳定程度，作为鉴别染色之用。01染色的基本程序8．复染

已脱色处理的细菌或其结构常以复染液作复染以便于观察。复染液与初染液的颜色不同而成一鲜明对比。复染不宜太强，以免掩盖初染的颜色。染料及染液配制技术目录/Contents1染色原理细菌染色染料的种类2染色的方法3染色的基本步骤401染色原理

微生物的染色是借助物理和化学因素的作用而进行的。物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。化学因素则是正负离子之间的相互吸引而发生的各种化学反应。酸性物质对于碱性染料较易吸附，且吸附作用稳固；同样，碱性物质对酸性染料较易于吸附。01染色原理

细菌的等电点较低，pH值大约在2~5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳离子。因此，带阴电的细菌常和带阳离子的碱性染料进行结合。故而在细菌学上通常采用碱性染料进行染色。

02染料的种类1.酸性染料如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑、苦味酸等。这类染料电离后染料离子带负电，可与碱性物质结合成盐。当培养基因糖类分解产酸使pH值下降时，细菌所带的正电荷增加，这时选择酸性染料，易被染色。02染料的种类2.碱性染料

一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，这类染料电离后染料离子带正电，可与酸性物质结合成盐，通常情况下，细菌容易被碱性染料染色。

02染料的种类3．中性（复合）染料

如伊红美兰等，瑞脱氏（Wright）染料和基姆萨氏（Gimsa）染料等，后者常用于细胞核染色。

02染料的种类4．单纯染料这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudanb)的染料。03染色的方法（1）单染色法单染色法是用一种染料染色的方法。比如用美蓝使各种细菌染成同—种颜色，此法只显示细菌的形态和大小，对细菌的鉴别价值较小。在染色过程中常加入媒染剂如碘、石碳酸或明矾等，来增加染料对细菌的亲和力，当然也可以使用加热的方法。03染色的方法（1）单染色法单染色法是用一种染料染色的方法。比如用美蓝使各种细菌染成同—种颜色，此法只显示细菌的形态和大小，对细菌的鉴别价值较小。在染色过程中常加入媒染剂如碘、石碳酸或明矾等，来增加染料对细菌的亲和力，当然也可以使用加热的方法。03染色的方法（2）复染色法复染色法是用两种或两种以上染料染色的方法。常用的复染色法有革兰氏染色法和抗酸染色法。复染色法能显示细菌的形态和大小，不同类型的细菌可以染上不同的颜色，从而具有鉴别细菌种类的价值，因此又称之为鉴别染色法。03染色的方法（3）细菌特殊结构的染色法检查细菌的特殊结构，如鞭毛、异染颗粒等对鉴别细菌很有帮助。细菌特殊结构染色法不仅能使特殊的结构着色，还可使特殊结构染成与菌体不同的颜色，有利于观察。在细菌检查工作中，异染颗粒染色法应用的较多，其他特殊结构染色法操作比较费时，又能用其他简易方法来代替，故而在日常检验工作中较少使用。03染色的方法（4）荧光染色法荧光染料溶于水中，在紫外线照射下能激发出荧光，细菌染色后镜检，即为荧光染色法。荧光染料分为酸性染料及碱性染料两种。细菌用荧光染料染色后在荧光显微镜下检查，可在黑的背景中观察到细菌发出明亮的荧光。用荧光染色法检查细菌可起到加快检查速度和提高阳