凝胶色谱法资料

凝胶色谱法添加摘要\o"点击查看原图"凝胶色谱系统凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要\o"有机溶剂"有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称\o"分子排阻色谱法"分子排阻色谱法。凝胶色谱法主要用于\o"高聚物"高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。目前已经被\o"生物化学"生物化学、\o"分子生物学"分子生物学、\o"生物工程学"生物工程学、\o"分子免疫学"分子免疫学以及\o"医学"医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于\o"工业"工业生产。凝胶色谱法-分类

根据分离的对象是\o"水溶性"水溶性的\o"化合物"化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为\o"凝胶过滤色谱"凝胶过滤色谱（GFC）和\o"凝胶渗透色谱"凝胶渗透色谱（GPC）。\o"点击查看原图"凝胶色谱仪凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶的代表是\o"葡萄糖"葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物(\o"聚苯乙烯"聚苯乙烯、\o"聚氯已烯"聚氯已烯、\o"聚乙烯"聚乙烯、\o"聚甲基丙烯酸甲酯"聚甲基丙烯酸甲酯等)相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为\o"四氢呋喃"四氢呋喃等有机溶剂。凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。\o"点击查看原图"凝胶渗透色谱技术原理凝胶色谱法-分子筛效益

一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶\o"色谱柱"色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的\o"微孔"微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫\o"分子筛效应"分子筛效应。具有多孔的凝胶就是\o"分子筛"分子筛。\o"点击查看原图"凝胶色谱法原理各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫\o"全排阻"全排阻。两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍。分级分离时柱高与直径之线为20：1─100：1，常用凝胶柱有50×25厘米，10×25厘米。层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支掌滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000。（二）凝胶的选择\o"点击查看原图"凝胶色谱柱根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如SephadexG-20的吸水量为20，1克SephadexG─200吸水后形成的凝胶体积约40ml。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细胞分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的SephadexG-200效果好，脱\o"盐"盐用SephadexG-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。（三）凝胶的制备商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在\o"沸水浴"沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时，自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。（四）样品溶液的处理样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，\o"点击查看原图"凝胶色谱净化系统如含脂类可高速离心或通过SephadexG-15短柱除去。样品的粘度不可大，含蛋白为超过4％，粘度高影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4％（一般约0.5-2ml），进行分族分离时样品液可为凝胶床的10％，在\o"蛋白质"蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20-30％。分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。（五）防止\o"微生物"微生物的污染

交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的\o"抑菌剂"抑菌剂有：⑴叠氨钠在凝胶层析中只要用0.02％叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶于水，在20℃时约为40％；它不与蛋白质或\o"碳水化合物"碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。⑵可乐酮\o"点击查看原图"凝胶色谱软件在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02％。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60℃⑶乙基汞代巯基水杨酸钠在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0.01％。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。⑷苯基汞代盐在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01％。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与\o"卤素"卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含巯基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。凝胶色谱法-高效凝胶色谱

在整个\o"液体色谱"液体色谱领域里，高效液体色谱取代经典的液体色谱的趋势是非常迅速的。这是由于色谱理论、\o"填料"填料制备技术和仪器合理设计三方面联合发展的必然结果。凝胶色谱向高效阶段发展就其本身来说，又是一次意义较大的进展，因为凝胶色谱虽然具有许多优点，但是它一直被认为是一种分离效率比较低、色谱柱的峰容量小和速度慢的技术。在广泛的非高分子化合物领域中没有得到应有的使用。

\o"点击查看原图"高温凝胶色谱在经典的凝胶色谱中，填料的粒度一般用37-75μ。色谱柱长12尺以上，柱径7.8毫米，流速通常用1毫升/分。在这些条件下，一次实验时间往往需要三小时。加快流速会降低分离效率，因为凝胶色谱是一个由扩散控制的分离过程，高分子在溶液中扩散较慢，这就必然使流速受到一定限制。凝胶色谱峰容量较小的原因是和体积排除的分离机理有关。这些缺陷的克服都有待于填料柱效的大幅度提高。高效凝胶色谱填料的合成成功以及高效装柱技术的发展，实现了柱效的提高，从而实现了实验时间缩短，峰宽变窄和峰容量增加。现在粒度为10μ的填料可以使\o"分子量"分子量分布测定时间从三小时缩短到十几分钟，这个时间甚至比高分子在溶剂中溶解所需的时间还短。在工业上已有人用凝胶色谱图来作为订购验收指定分子量分布的高聚物产品。由于不需要费太多时间来做条件试验，凝胶色谱在一般化合物领域里应用时的方便程度已可以和其他类型高效液体色谱相竞争。凝胶色谱法-研究动向

最近凝胶色谱的大量研究工作仍是多方面的，其中\o"仪器"仪器、填料、\o"联用技术"联用技术、\o"色谱理论"色谱理论等方面的进展是和整个液体色谱的进展相关的。但是下面四个研究动向意义较大，值得注意。

\o"点击查看原图"示差折光检测凝胶色谱通过与其他仪器联用，解决凝胶色谱法测定高聚物分子量分布从相对法向绝对法过渡。测定高聚物分子量分布是凝胶色谱最重要的应用。试样先根据分子体积(即分子量)分离后再检测各组分的分子量及含量。在凝胶色谱中试样的分离是在色谱柱中进行的，被分离后的组分在流出柱子时就同时连续地用浓度检测器和分子量检测器分别检侧各组分的浓度和分子量，把两个检测器的输出讯号用记录仪记录后即得反映分子量分布的凝胶色谱曲线。过去由于没有比较灵敏和瞬时响应的分子量\o"检测器"检测器，因而利用一组不同分子量的标样来标定色谱柱，然后从分子量淋出休积的标定曲线来作数据换算。这种用相对方法来检测分子量虽然暂时解决了问题，但是随之而来的是实验工作量增加以及数据处理方法上存在困难。实验数据的可靠性在很大程度上决定于标定曲线、标样分子量数值以及数据处理方法的可靠性。其中色谱柱分离效率不理想所引起的色谱峰加宽效应的改正，不但实验方法比较烦琐，而且数据处理也比较复杂，需要用电子计算机来计算。所以虽然文献中已经推荐许多据说是比较满意的计算方法，但这总不是一个根本解决的方法。只有真正找到绝对分子量检测器，问题才算较好解决。原有的许多分子量测定方法，由于不能做到足够灵敏的瞬时响应而未能成功地在凝胶色谱上应用。\o"点击查看原图"凝胶色谱分析图最近Ouano用\o"激光"激光小角光散射仪(LALLS)来作分子量检测器得到比较好的结果。实验数据不需要标定曲线，也不必进行峰加宽改正。

由于激光的准直性较好，强度较大，可以允许在较小的角度下测量较稀溶液的散射光强，由此可以直接计算出重均分子量的近似值而不需要象经典光散射那样实验数据还要对浓度和散射角度向零作双外推。实验上，凝胶色谱仪和激光小角光散射仪联用后，还可与计算机直接联接进行数据处理。在一次实验进行完毕后，所需要的数据可全部立即取得。GPC-LALLS似乎得到更合理的数值。激光小角散射仪已开始商品化，预计不久将会有更多的研究工作，来说明已经在何种程度上解决了凝胶色谱的相对测定过渡到绝对测定。凝胶色谱中的浓度检测器和通常的液体色谱一样仍然是一个薄弱环节，继续在寻找更理想的检测器。目前最常用的仍然是\o"示差折光检测器"示差折光检测器和\o"紫外检测器"紫外检测器。\o"点击查看原图"凝胶色谱柱最近Hoffmann和Urban用自动\o"浊度"浊度滴定装置来作浓度检测器也收到一定效果，特别对二元共聚中测定分子量分布和组成分布，效果比较显著。Jorgenson等用光\o"散射法"散射法侧定淋出溶质的\o"沉淀"沉淀，也证明是一个较灵敏的方法。Francois等用\o"密度计"密度计来检侧浓度，提供了另一条通用性检测器的途径。其他如质谱和原子吸收光谱也都能与凝胶色谱联用。随着应用的扩大，凝胶色谱可以用于测定高聚物长支链的\o"支化度"支化度。凝胶色谱法-相关词条

\o"分子排阻色谱法"分子排阻色谱法，\o"凝胶过滤色谱"凝胶过滤色谱，\o"凝胶渗透色谱"凝胶渗透色谱，\o"分子筛效应"分子筛效应，\o"塔板数"塔板数，\o"塔板理论"塔板理论，\o"层析柱"层析柱，\o"琼脂"琼脂，\o"电泳"电泳，\o"填料"填料，\o"联用技术"联用技术，\o"色谱理论"色谱理论，\o"生物化学"生物化学，\o"示差折光检测器"示差折光检测器，\o"紫外检测器"紫外检测器。凝胶色谱法-参考文献

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