当归注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤后P57kip2蛋白表达的影响

当归注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤后P57kip2蛋白表达的影响【摘要】目的：观察当归对缺血再灌注损伤心肌细胞内P57kip2蛋白表达的影响，探讨当归抗心肌缺血再灌注损伤保护作用的机理。方法:将35只SD大鼠随机分成4组:正常对照组(n=5)；假手术组(n=10)；缺血再灌注组(n=10)；当归治疗组(n=10),建立在体心肌缺血再灌注动物模型。实验完毕后，将各组动物心肌组织做免疫组织化学染色，观察各组动物心肌细胞内P57kip2蛋白表达的变化。利用HPIAS2000图像分析系统测定P57kip2蛋白在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：正常对照组心肌细胞内P57kip2蛋白表达强，当归治疗组心肌细胞内P57kip2蛋白表达强，假手术组心肌细胞内P57kip2蛋白表达较强，缺血再灌注损伤组P57kip2蛋白表达弱。图像分析结果显示：正常对照组、当归治疗组、假手术组与缺血再灌注损伤组之间P57kip2蛋白的平均光密度及阳性面积率的差异有显着性意义()；正常对照组与假手术组之间、当归治疗组与假手术组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显着性意义(P005)。结论：当归注射液对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞的增殖起着重要的作用。

【关键词】当归注射液；缺血再灌注；心肌；P57kip2蛋白

心肌缺血再灌注损伤(ischemiareperfusioninjury,IRI)在急性心肌梗死再灌注治疗的病理生理过程中起着重要的作用。近年来研究发现心肌缺血再灌注损伤与细胞凋亡有着密切的关系。赵明中等［1］研究发现心肌缺血再灌注可减少心肌缺血细胞凋亡,同时也能加速受损心肌细胞的凋亡过程，且凋亡细胞主要位于心肌纤维收缩带区域内和心肌梗死区周围。心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡随再灌注时间的延长而显着增多。近年来凋亡机制参与心肌缺血再灌注损伤成为临床研究的热点。

目前在研究药物治疗心肌缺血方面还没有任何一种药物能绝对减少心肌梗死,对抗心肌缺血。当归为伞形科植物当归Angelicasinennsis(Oliv.)Diels的干燥根，味甘、辛,性温，能补血和血,调经止痛,润燥滑肠。有文献报道［2］,当归对冠心病患者应用当归注射液治疗能平衡和抑制血小板聚集的作用，因而能明显改善胸痛、胸闷等临床症状和心电图缺血性STT的变化,是治疗冠心病的有效药物［3］。

P57kip2是细胞周期素依赖蛋白激酶抑制因子中新发现的重要因子［4］，它能结合CyclinCDK复合物，抑制细胞从G1期到S期的转化，从而抑制细胞增殖，被认为是一种新型的肿瘤抑制基因［5］。

本实验采用免疫组织化学方法观察当归注射液对缺血/再灌注过程心肌的保护作用,研究当归注射液抗心肌缺血/再灌注损伤的作用机理，旨在指导临床合理应用当归治疗心血管疾病,开辟当归在体外循环手术前和术中应用的新途径。

1材料与方法

动物模型制备及分组

选用健康雄性Wistar大鼠35只,体重250～300g左右。腹腔注射戊巴比妥钠mg·(100g)-1,麻醉动物后行气管切开接微型呼吸机人工呼吸［呼吸频率60次·min-1,潮气量2ml·(100g)-1］,沿胸骨左缘第4肋骨开胸在左心室、右心室与左心房交界处结扎/开放左冠状动脉前降支建立心肌缺血再灌注模型。将动物随机分成4组:正常对照组；假手术组；缺血再灌注损伤组(IR)；当归注射液预处理组。

主要试剂

25%当归注射液(武汉大学中南医院制药厂)；即用型兔抗鼠P57kip2单克隆抗体、即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸。

方法

常规HE染色

免疫组织化学SP法检测P57kip2相关抗原主要步骤：5μm组织切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢处理10min以抑制内源性过氧化物酶活性，P57kip2采用高压抗原修复，正常羊血清处理10min以减少非特异性背景，一抗4℃孵育过夜，生物素标记的二抗处理10min，链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物处理10min，DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应，苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组，人乳腺癌作为P57kip2的阳性对照组。

免疫组织化学结果判断

P57kip2以细胞核或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。采用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对P57kip2抗原的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。

统计学处理

对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和q检验，检验水准α为。

2结果

HE染色

正常对照组：可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，细胞核位于细胞中央，细胞界限清晰，结构正常；假手术组：可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，但可见部分胞浆溶解，结构基本上正常；缺血再灌注损伤组：可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，胞浆溶解呈空泡或网状，细胞界限模糊，可见心肌细胞断裂；当归治疗组：可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，细胞核呈椭圆形位于中央，细胞结构基本正常。

P57kip2蛋白的表达

正常对照组：心肌细胞内可见棕黄色颗粒沉积，P57kip2蛋白表达强；假手术组：心肌细胞内可见棕黄色颗粒，P57kip2蛋白表达较强；缺血再灌注损伤组：心肌细胞内可见少量的棕黄色颗粒，P57kip2蛋白表达弱；当归治疗组：心肌细胞内可见棕黄色颗粒沉积，P57kip2蛋白表达强。图像分析结果见表1，经单因素方差分析，各组间的差异有显着性意义(P＜)。经q检验，正常对照组、当归治疗组、假手术组与缺血再灌注损伤组之间P57kip2蛋白的平均光密度及阳性面积率的差异有显着性意义()；正常对照组与假手术组之间、当归治疗组与假手术组之间P57kip2蛋白的平均光密度及阳性面积率的差异无显着性意义(P005)。

表1当归注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤后各组P57kip2蛋白表达的平均光密度和阳性面积率

注：*正常对照组、假手术组、当归治疗组与缺血再灌注损伤组比较，P＜；#当归治疗组、假手术组与正常对照组比较，P＞。

3讨论

细胞凋亡(apoptosis)是细胞死亡形式之一,是有核细胞在一定条件下启动其自身内部机制,通过内源性DNA内切酶的激活而发生自然死亡的过程。越来越多研究表明,心肌缺血/再灌注(I/R)损伤与细胞凋亡密切相关。

当归含有阿魏酸、多种磷脂、人体必需氨基酸和微量元素等。目前已证明,当归对心血管系统、血液造血系统、免疫系统、抗氧化和清除自由基等多方面均有肯定的药理作用。在心血管疾病中,经常发生缺血再灌注损伤,其机制可能是多因素的,但主要有3个环节，即能量代谢失常、钙超载和氧自由基生成,其中氧自由基是造成缺血再灌注损伤的直接原因［6］。缺血再灌注过程中,机体可通过多种途经产生氧自由基,氧自由基与生物膜发生一系列反应,可破坏心肌细胞结构、损伤心肌细胞膜,产生大量的脂质过氧化物。自1977年Hearse首次提出缺血再灌注损伤慨念以来，已逐渐引起医学界的高度重视。大量动物实验显示，氧自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、血管内皮细胞、一氧化氮、中性粒细胞、细胞黏附分子和细胞凋亡等均可能参与再灌注损伤的发病过程。目前虽然对缺血或缺血再灌注损伤的确切机制还不十分清楚,但已经知道损伤的临床结局主要就是细胞死亡。已经证实,人类心肌梗死除细胞坏死外,细胞凋亡也参与了梗死的病理过程,细胞凋亡不仅影响梗死面积,而且促成心脏结构的重构,心肌梗死的早期和晚期均存在凋亡现象［7～9］。缺血再灌注损伤对心肌组织的结构和功能的影响一直是研究的重点之一。

P57kip2对细胞的生长有着极其重要的调控作用，主要通过抑制CDKs复合物和PCNA功能来实现其作用，一方面P57kip2蛋白通过其氨基末端形成二聚体后，与cyclinECDK2、cyclinACDK2和cyclinDCDK2等G1期和S期激酶复合物结合，抑制其对Rb蛋白的磷酸化，E2F不能释放而使细胞不能通过G1期［10］；另一方面,抑制CDK2Thr160磷酸化而抑制CDK2的激活，还可通过羧基端与PCNA的结合，抑制细胞的增生［11］。P57kip2蛋白参与细胞增殖与分化的调控，并与细胞凋亡有关。P57kip2阳性表达的细胞绝大部分为终末期分化的细胞，这说明P57kip2在细胞分化过程中作用于细胞周期。P57kip2负性调节细胞增生的生物学功能提示它可能具有肿瘤抑制作用，而成为一个候选抑癌基因。Nijjar等人在体外实验中发现，G0期或细胞周期中端粒酶地活性或无活性时，P57kip2蛋白有大量聚集，而当细胞过度生长时则发现P57kip2蛋白明显减少甚至消失［12］。以上研究表明P57kip2表达的下调与肿瘤的细胞增殖进展有关。

本实验采用免疫组织化学方法观察当归注射液对缺血/再灌注过程心肌组织中P57kip2蛋白的表达,实验结果表明，正常对照组、当归治疗组、假手术组与缺血再灌注损伤组之间P57kip2蛋白的平均光密度及阳性面积率的差异有显着性意义()；正常对照组与假手术组之间、当归治疗组与假手术组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显着性意义(P005)。以往的相关研究显示，P57kip2蛋白的表达水平受到多种因素的调控,如泛素化降解、抗增殖信号因子、细胞因子及接触抑制等［15］。IoannisS.Pateras等人［16］在对70例非小细胞肺癌的研究中发现，P57kip2mRNA和P57kip2蛋白有明显的相关性，提示P57kip2蛋白的表达可能在转录水平调节；启动子的甲基化是P57kip2mRNA水平降低的主要原因；肿瘤细胞中高表达的Skp2也促进P57kip2蛋白的降解。ZhuoChen等人［17］的研究表明TGFβ能通过作用于P57kip2启动子附近的一段高度保守区域而显着上调P57kip2mRNA和P57kip2蛋白水平，而对KIP家族中的另两个成员P21和P27却无此作用。

缺血再灌注损伤本身是个多因素协同的过程,缺血再灌注组织发生细胞凋亡的机制也是一个多因素的过程,心肌细胞坏死与细胞凋亡有着一些共同的始动因素,如氧自由基、钙离子超载、细胞因子的释放、中性粒细胞侵润等既可以引起细胞凋亡,也可以引起细胞坏死，无疑通过各个环节对抗细胞凋亡必然也会对抗细胞的坏死起一定的作用。现在对心肌缺血再灌注引起细胞凋亡的确切机制尚未阐明,对抗心肌细胞凋亡的治疗也大多处于动物试验阶段。特别是基因治疗离临床应用还有一段距离。

从以上的实验结果和讨论来分析当归注射液为防治缺血再灌注损伤的应用具有重要的研究意义，并且为加强心肌保护作用提供了重要的理论依据。

【参考文献】

1赵明中,陈运贞.大鼠实验性心肌缺血再灌注时细胞凋亡的动态变化及意义.基础医学与临床,2000,20(1):52～55.

2魏蕾,欧阳静萍,王雄,等.当归对高分子右旋糖酐诱导人红细胞聚集性增强的影响.微循环学杂志,2001,11(1):30～31.

3袁新初,张端莲.当归注射液对更年期大鼠超氧化物歧化酶和脂质过氧化物的影响.中草药,2001,32(9):822～823.

4ItoY,YoshidaH,Nakanok,etal.Expressionofp57kip2proteininnormalandneoplasticthyroidtissues.IntJMolMed,2002,9(4):373～376.

5ItoY,TakedaT,SasaldY,etal.Expressionofp57kip2proteininextrahepaticbileductcarcinomaandintrehepaticcholangiocellularcarcinoma.Liver,2002,22(2):145～149.

6齐丽彤,张钧华,李大元,等.血管紧张素ⅡⅠ型受体阻断剂抑制大鼠缺血再灌注模型心肌细胞凋亡.中华心血管病杂志,2001,29(2):118～121.

7徐新春.钙超载与心肌缺血再灌注损伤.心血管病学进展,2000,21(4):227.

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9QinY,VandenHoekTL.Caspasedependentcytochromecreleaseandcelldeathinchickcardiomyocytesaftersimulatedischemiareperfusion.AmJPhysiolHeartCircPhy