十三碱变性法小量制备质粒DNA课件

分子生物学实验分子生物学实验1实验目录碱裂解法小量制备质粒DNA2.感受态细胞制备3.质粒转化4.聚合酶链式反应（PCR）实验目录碱裂解法小量制备质粒DNA2实验一碱变性法小量制备质粒DNA实验一碱变性法小量制备质粒DNA3一、实验目的掌握碱裂解法提取质粒的方法一、实验目的4二、实验原理二、实验原理5分离质粒DNA方法碱变性法煮沸法SDS法羟基磷灰石层析法等各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化分离质粒DNA方法6碱变性法基本原理在pH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA碱变性法基本原理在pH12.0-12.6碱性环境中，线性的7三、实验材料三、实验材料8

实验试剂

ＬＢ培养基：胰化蛋白胨10g酵母提取物5g定容1000mlpH7.5NaCl10gＳＴＥ：

0.1MNaCl10mMTrisHCl(pH8.0)1mMEDTAＡｍＰ50mg/ml溶菌酶10mg/ml(用10mMTris·HClpH8.0新鲜配制）

实验试剂

ＬＢ培养基：9溶液Ⅰ：50mM葡萄糖25mMTris·HCl（pH8.0）10mMEDTA溶液Ⅱ：（新鲜配制）0.2NNaOH1%SDS溶液Ⅲ：5MKAC10ml冰醋酸11.5ml水28.5ml酚，氯仿，乙醇RNase琼脂糖ＴＥ：10mMTris-HCl(pH8.0)1mMEDTA溶液Ⅰ：10四、实验方法

１．挑取琼脂培养板上的单菌落至5mlLB培养液中（含AmP50μg/ml），３７℃强烈摇荡过度２．取1.5ml培养液至Eppendorf管中，12000g离心30秒，弃上清，用１mlSTE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀３．将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中，振荡混匀，冰上放置5分钟四、实验方法

１．挑取琼脂培养板上的单菌落至5mlLB培养11四、实验方法

４．加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒以混匀内容物，冰上放置5分钟５．加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟６．12000g4℃离心５分钟，取上清移到１个新的Eppendorf管中７．加入等体积酚/氯仿（１：１），振荡混匀，12000g4℃离心２分钟。取上清移至另１个Eppendorf管中四、实验方法

12

８．加入２倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2分钟。９．12000g,4℃离心５分钟。10．弃上清，加入１ml70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数次，12000g4℃离心２分钟。11．弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5-15分钟）。12．加入50μlTE（含20μg/ml

RNA酶，不含DNA酶）溶解DNA。８．加入２倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2分钟。13

13．取10μlDNA溶解液用ＴＥ稀释至1000ul测定OD260和OD280,计算OD260/OD280之比14.同时以以下公式计算得率质粒DNA得率：稀释倍数×OD260×0.05×50/1.5ml15．取10μlDNA溶解液加2μlLoadingbuffer于1%琼脂糖,电泳3小时,电压40伏。16．电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察，记录结果13．取10μlDNA溶解液用ＴＥ稀释至1000ul测14五、实验结果分析１．根据质粒DNAOD260,OD280值，计算质粒DNA得率和DNA纯度２．记录电泳结果并说明结果内容五、实验结果分析15六、思考题

１．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及实验中分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因２．简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因六、思考题

１．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及实16实验二

大肠杆菌感受态细胞制备实验二

大肠杆菌感受态细胞制备17实验目的学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法实验目的学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法18实验原理感受态：细菌能够吸收外源DNA的生理状态称为感受态细菌经低渗氯化钙处理后，细胞膨胀、细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过细胞的状态本实验以E.coliDH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于为感受态实验原理感受态：细菌能够吸收外源DNA的生理状态称为感受态19实验仪器

实验仪器20超净工作台超净工作台21台式高速冷冻离心机台式高速冷冻离心机22恒温空气摇床恒温空气摇床23实验试剂

大肠杆菌DH5α

LB培养基，

0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）实验试剂

大肠杆菌DH5α24实验步骤

菌株活化感受态细胞制备实验步骤菌株活化25实验步骤

菌株活化1．用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时2．挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时3．将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2－3小时，到OD600＝0.3－0.4实验步骤菌株活化26感受态细胞制备4．将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15－30min5．6000rpm离心10min,弃上清6．加入0.3ml预冷的0.1mol/lCaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min7．4000rpm离心5min,弃上清8．加入0.2ml预冷含有甘油的0.1mol/lCaCl2,悬浮沉淀，即为感受态细胞，可－70℃长期保存感受态细胞制备27思考题1.常用制备感受态细胞的大肠杆菌有哪些2.第8步中氯化钙溶液中甘油的作用是什么思考题1.常用制备感受态细胞的大肠杆菌有哪些28实验三

氯化钙诱导质粒转化实验三

氯化钙诱导质粒转化29实验目的1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义2.学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞并筛选转化体的方法实验目的1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义30转化将外源DNA分子引入受体细胞，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术转化将外源DNA分子引入受体细胞，使受体细胞获得新的遗传31电击法CaCl2、RuCl等化学试剂法常用转化方法电击法常用转化方法32实验原理本实验以E.coliDH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于为感受态，加入pUC18质粒，在钙离子的作用下，质粒与钙离子形成复合物吸附在细菌细胞表面，经42℃短暂热刺激，细胞膜通透性增大，可吸收吸附的质粒DNA，即实现转化实验原理本实验以E.coliDH5α菌株为受体细胞，用33实验原理pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，接受该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性。将转化后的受体细胞于含氨苄青霉素平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡实验原理pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，接受该质粒的34抗Amp宿主细菌含Amp培养基抗Amp宿主细菌含Amp培养基35影响转化率的因素

细胞生长状态和密度转化的质粒DNA质量、浓度试剂的质量防止杂菌和其它外源DNA污染影响转化率的因素细胞生长状态和密度36实验仪器

实验仪器37超净工作台超净工作台38台式高速冷冻离心机台式高速冷冻离心机39恒温空气摇床恒温空气摇床40恒温培养箱培养皿恒温培养箱培养皿41实验试剂

感受态细胞大肠杆菌DH5α

LB培养基，

0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）

氨苄青霉素

pUC18质粒

实验试剂

感受态细胞大肠杆菌DH5α42实验步骤

1.取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min2.于42℃水浴90S3.冰上放置2min4.加入1mlLB液体培养基于37℃培养1小时实验步骤1.取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上43实验步骤

5.3000rpm离心2min6.吸出上清液0.8ml，将剩余液体轻轻吸打、混合均匀7.将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上8.将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果实验步骤5.3000rpm离心2min44对照组对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落

对照组对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操45转化率

转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：

转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)

转化率转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据46

感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数

感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂47实验结果实验结果48思考题分子生物学中常用的载体有哪些实验步骤第4步加入1mlLB液体培养基于37℃培养1小时的作用是什么思考题分子生物学中常用的载体有哪些49实验四聚合酶链式反应（PCR）实验四聚合酶链式反应（PCR）50实验目的通过本实验学习PCR反应基本原理与实验技术实验目的通过本实验学习PCR反应基本原理与实验技术51实验原理聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。实验原理聚合酶链式反应(polymerasechainr52PCR技术原理1.变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性2.退火：是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段3.延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链PCR技术原理53(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的扩增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互补链引物1互补链单位长度的链不同长度的链5’3’3’5’引物1互补链引物2互补链目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图(e)(f)(g)(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’354十三碱变性法小量制备质粒DNA课件55十三碱变性法小量制备质粒DNA课件56十三碱变性法小量制备质粒DNA课件57十三碱变性法小量制备质粒DNA课件58十三碱变性法小量制备质粒DNA课件59温度（℃）时间（min）94726094℃变性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循环1循环2循环3PCR反应的温度循环周期PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止温度（℃）时间（min）9494℃变性（1min）60℃退60

1.引物

2.4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)3.Mg2+4.模板

5.TaqDNA聚合酶

6.反应缓冲液PCR反应中的主要成份

1.引物PCR反应中的主要成份61实验仪器电泳仪实验仪器电泳仪62琼脂糖凝胶电泳槽琼脂糖凝胶电泳槽63PCR仪PCR仪64凝胶成像系统凝胶成像系统65移液器移液器66实验材料1、DNA模板2、4种dNTP3、引物1、引物24、Taq酶5、琼脂糖6、DNA相对分子质