五子衍宗汤对环磷酰胺致小鼠生精障碍的保护作用

五子衍宗汤对环磷酰胺致小鼠生精障碍的保护作用

五子衍宗汤由枸杞、兔蚕丝、五味子、覆盆子和香蕉籽组成。具有补肾益精、补精补髓的功效。主要用于肾衰竭、阳痿、早泄和长期不育。它通常用于治疗男性不育。然而，五子衍宗汤是否对抗旱药物引起的生精障碍的药理作用尚不清楚。1材料和方法1.1样品的提取五子衍宗汤由枸杞子、菟丝子、覆盆子、车前子、五味子组成,全部生药经三峡大学医学院汪鋆植教授鉴定为正品。按照传统方法煎药,浓缩至粉末,提取率为18.8%,临用前配成相应浓度的溶液;注射用环磷酰胺,规格为0.2g,批号08121021,江苏恒瑞医药股份有限公司。1.2实验动物及生产许可证BalB/c种雄性小鼠,SPF级,8~9周龄,22g~25g,湖北省实验动物中心提供,动物生产许可证号SCXK(鄂)2008-0005。1.3酚红素f-1.3.4%的酚红Bouins液:苦味酸饱和水溶液750mL,甲醛250mL,冰醋酸50mL。精子营养液:BWW(NaCl0.554g/L、KCl0.0356g/L、CaCl20.025g/L、KH2PO40.0162g/L、MgSO4·7H2O0.0294g/L、NaHCO30.210g/L、NaPyr0.003g/L、Nalac0.370g/L、Glucose0.100g/L、质量分数0.5%的酚红1.0mL、青霉素10000U、质量分数0.3%的BSA。其余药品均为分析纯。1.4多功能显微及图像分析系统SQIAS-2000彩色精液质量图文分析仪,武汉千屏影像技术有限责任公司;DMR型多功能显微镜及图像分析系统,德国Leica公司;H-7500型透射式电子显微镜,德国Leica公司;ULTRACUTR型超薄切片机,奥地利莱卡公司;JA2003型电子分析天平,上海天平仪器厂。1.5方法1.5.1连续注射环磷酰胺水解反应32只BalB/c雄性小鼠,随机分为4组,依次为空白对照组、模型组、五子衍宗汤低剂量组、五子衍宗汤高剂量组。除空白对照组外,其余小鼠腹腔注射环磷酰胺50mg/kg,连续注射7d,空白对照组腹腔注射等量生理盐水。空白对照组和模型组每天灌服1%羧甲基纤维素钠0.2ml,五子衍宗汤低剂量组给予五子衍宗汤2g/kg,五子衍宗汤高剂量组给予五子衍宗汤4g/kg,各组小鼠连续给药35d。1.5.2大鼠生殖器官的重量测量1.5.3精子浓度的测定将盛有6ml精子营养液的试管置于恒温水浴箱预热至37℃,取单侧附睾去除脂肪,剪碎放入试管中摇匀,37℃保温10min~15min,使精子充分游离,接着取1滴滴入牛鲍氏血细胞计数板上,计算每毫升精子数。用微量移液器吸取10μl精子悬液,利用SQIAS-2000彩色精液质量图文分析仪进行精子活率测定。1.5.4独立液液的制备取单侧睾丸去除包膜、剪碎,置于3mlpH7.4的PBS试管中,于漩涡震荡混合器上混合3min,组织细胞液用200目尼龙网过滤于试管内,1500r/min离心5min,弃上清将沉淀悬浮后加3mlPBS,混匀1min,同样条件重复洗涤2次,制成单细胞悬液。PBS调整细胞浓度至106~107个/ml4℃、70%乙醇固定2h后,低速短时离心去除固定液,PBS洗2遍,加40μg/ml的RNA酶400μl,于37℃水浴30min,加入100μlPI染液混匀,4℃避光染色30min即可上机进行检测,计算出不同倍体细胞的百分比。1.5.5睾丸组织内精原细胞与各级生精细胞的分布取单侧睾丸石腊切片,HE染色,光镜观察睾丸组织内精原细胞与各级生精细胞的分布情况。环氧树脂包埋,做超微切片,电镜观察睾丸组织内曲细精管及各级生精细胞超微结构的变化。1.5.6统计处理数据经SPSS13.0软件处理,实验各个指标均用均数±标准差表示,各组均数之间比较进行one-wayANOVA检验。2结果2.1五子衍宗汤对大鼠睾丸和附件的影响表1显示,模型组小鼠睾丸重量和附睾重量显著低于空白对照组,五子衍宗汤低、高剂量均可增加小鼠的睾丸及附睾重,但无显著性差异。2.2水平空白对照组表2显示,模型组小鼠精子密度、精子活率显著低于空白对照组。五子衍宗汤低、高剂量均可显著增加生精障碍小鼠的精子密度。五子衍宗汤低、高剂量对生精障碍小鼠的精子活率也有一定的提升作用。2.3细胞配比表3显示,模型组小鼠1C和4C细胞百分比显著下降,2C细胞百分比相对升高。五子衍宗汤低、高剂量均可显著增性恢复生精障碍小鼠各级生精细胞的百分比。2.4睾丸生精管间隙的测定光镜可见,模型组小鼠睾丸内生精小管多退化、萎缩,管壁生精上皮变薄,生精细胞层数减少,排列紊乱,精子细胞较少,腔内精子少见,睾丸生精小管间隙明显增大。五子衍宗汤组小鼠睾丸内大部分生精小管的各级生精上皮细胞层次较明显,排列较规则,管腔内可见较多成熟精子生成,基本达到正常的睾丸组织形态(结果见图1)。2.5生精细胞凋亡电镜下可见,模型组小鼠睾丸生精细胞较少,并可见明显的生精细胞凋亡;治疗组睾丸超微结构明显恢复,五子衍宗汤组可见生精上皮变厚,见正常形态的精原细胞、精母细胞且生精上皮的中部有爆发产出的大量精子(结果见图2)。3子衍宗汤对环磷酰胺致生精障碍的保护作用环磷酰胺是一种临床常见的抗肿瘤药物,其机制主要是通过对DNA的烷化作用而干扰细胞内多种生物学功能。近代研究表明,环磷酰胺具有明显的生殖毒性,对睾丸有明显的损伤作用,导致无精子症或少精子症,造成不育。通过临床研究发现,在儿童期因白血病、实体肿瘤、自身免疫性疾病接受环烷化剂环磷酰胺治疗的男性患儿,成年后80.2%~92.6%为无精子症或少精子症,可导致不育或者出现子代遗传性缺陷或畸形。中医药对生精障碍有较好的治疗效果,但对环磷酰胺所致生精障碍的治疗仍缺乏深入的研究。五子衍宗汤为临床治疗男性不育的常用方剂,本实验探讨了五子衍宗汤对环磷酰胺致小鼠睾丸功能损害及生精障碍的保护作用。本研究发现,在环磷酰胺致生精障碍小鼠模型中,小鼠睾丸重量、附睾重量、精子密度、精子活率等显著下降,生精小管退化萎缩,生精上皮层次减少,细胞排列紊乱,初级精母细胞(4C细胞)与精子细胞和精子(1C细胞)比例显著减少。五子衍宗汤能够拮抗环磷酰胺的生殖毒性,提高睾丸和附睾重量;显著增加生精障碍小鼠的精子密度及精子的活率;修复睾丸生精小管生精上皮损伤,使生精小管结构基本恢复正常;促进精原细胞向初级精母细胞转化,恢复各级生精细胞的比例。睾丸是精子的生成场所,附睾则对精子的成熟起重要作用。研究结果提示,