木本植物组织培养的研究进展

木本植物组织培养的研究进展

随着植物组织培养的深入，木本植物组织培养技术不仅促进了果树和观赏树木的脱毒和组织培养迅速发展，而且在保持生态平衡、改变沙害土壤、城市和居民的绿化方面发挥了重要作用。至今世界上已有多种木本植物离体培养后得到了完整植株,有不少试管苗已应用于生产实践。木本植物具有生命周期长、遗传杂合几率高、经济效益显著等特点。此外,许多木本植物组织培养过程中存在着难以解决的外植体褐变、试管苗玻璃化和生根难等现象。因此,对影响木本植物组织培养的有关因子进行研究,有利于木本植物组织培养工作的进一步开展。1影响木本植物组织培训的相关因素和进展1.1生长素的作用(1)基本培养基。在器官组织培养中,一般采用固体培养,而在细胞和原生质体培养中,则采用液体培养基。培养基中的盐浓度对外植体褐变和试管苗玻璃化均有一定影响。对某些植物来说,初代培养时培养基中无机盐浓度过高可引起酚类外溢物质的大量产生,导致外植体褐变,降低盐浓度则可以减少酚类外溢,从而减轻褐变。此外,培养基中的某些离子会增加酚类合成与氧化酶的活性,降低盐浓度则可起到一定的抑制作用。对于玻璃化的试管苗来说,提高培养基中Ca2+的浓度,增加培养基中MgMn、K、P、Fe、Cu元素含量,降低N和Cl元素比例,特别是降低铵态氮浓度,可降低玻璃化。(2)生长调节物质。在组织培养过程中,激素的种类及浓度对培养结果有重要影响。在以杨树为材料的试验中发现,愈伤组织在芽分化阶段如果不降低生长素浓度,则很容易永远失去分化能力。而植物的生根多数都是用生长素单独实现的,IBA有较好促进生根的作用。用幼年状态的材料在低浓度生长素的培养基中一步生根,生根效果明显优于含有高浓度生长素的培养基;当他尝试用不含生长素的培养基一步生根时,仍观察到幼年状态的材料有一定生根效果。这说明生长素完成诱导作用后,它们在培养基中存在对新根发生有抑制作用。因此,对木本植物的生根培养采用两步法:即先在富含生长素的培养基上进行根的诱导,尔后转接到无任何生长调节物质的培养基上进行根的伸长生长。这样不仅可提高生根率和有效根的数目,而且可限制芽苗基部愈伤组织的生成。(3)碳源。糖的使用浓度多在2%~3%,但不同植物材料对糖类的反应不完全相同。杨树培养基中糖的使用浓度若超过3%,则易使愈伤组织变黑老化;另一方面,糖浓度太低也不宜于愈伤组织的诱导和分化。对于已发生玻璃化的试管苗来说,适当提高培养基中蔗糖含量,降低培养基中的渗透势,可以降低玻璃化。(4)琼脂。在固体培养时,琼脂的使用浓度常为0.6%~0.8%。邓成木认为应尽可能地降低琼脂的浓度,因为较软的培养基能诱导愈伤组织较好地发育,而太硬的培养基往往会使培养物不能与培养基紧密接触,不能很好地吸收养分而变黄。但孔祥生等在柿树组培试验中发现,琼脂含量低则试管苗水势高,玻璃化现象严重。把琼脂含量从0.6%提高到1.0%后,不仅能有效防止玻璃化现象的发生,而且提高了外植体的增殖倍数。(5)培养基的pH值。培养基的pH值因培养材料不同而异,大多数木本植物要求pH值在5.0~6.0。适当降低培养基pH值可以降低多酚氧化酶的活性和底物利用率,从而抑制褐变。培养基的pH值还可以通过影响培养物的营养元素的吸收过程来影响呼吸代谢、多胺代谢与脱氧核糖核酸合成、植物激素进出细胞等作用,进而直接或间接地影响愈伤组织形成及形态建成。(6)活性炭。活性炭(AC)不是组织培养中的必需成分,但现有资料显示,活性炭在许多木本植物的组织培养中起着重要作用。赖家业在土柠檬、韩文璞在甜樱桃的组织培养中分别发现活性炭能明显地促进芽和根的生长。但由于活性炭具有较强的吸附能力,它能使培养基内有效物质的浓度降低,从而限制某些植物的生长。刘用生在胡杨的培养基中加入活性炭后芽丛不再增殖,甚至2周后芽开始萎黄。AC对外植体褐变有一定的抑制作用。活性炭除了能吸附培养基中的酚类物质、减轻对培养物的毒害外,还在一定程度上降低光照强度,从两方面减轻褐变。李师翁等在沙棘组织培养中,加入活性炭有减轻褐化的作用,但同时也抑制了愈伤组织和芽的生长。刘用生研究活性炭吸附作用的结果表明:每mg的AC大约能吸附100μg左右的生长调节物质,通常,AC的使用浓度在0.02%~1%之间。1.2早冬春季差异培养法外植体的选择和处理对褐变有较大影响。Chever分析欧洲栗的酚类含量的变化结果表明,幼龄材料酚类化合物含量少,而成龄材料比较多。王续衍对24个苹果品种进行茎尖培养时发现,以冬春季取材褐变死亡率最低,其他季节取材则都不同程度加重。此外,外植体组织受伤害程度直接影响褐变,在切取外植体时,伤口面积越小,表面消毒剂对外植体伤害越少,褐变越轻。1.3组培苗的温度和培养次数对根系的影响(1)光照。光照对木本植物的外植体褐变和试管苗玻璃化有一定影响。光照过强,可使多酚氧化酶的活性提高,从而加速被培养组织的褐变。但增加光照,可促进试管苗成熟,加快幼茎木质化,从而降低玻璃化。光照还影响一些木本植物的生根。研究发现,对Calita李的生根培养,两周的黑暗处理对获得最大生根率是不可缺的,光照则抑制根的形成。(2)温度。低温可以抑制酚类化合物的合成,降低多酚氧化酶的活性,从而减轻褐变,Wang等在苹果和桃的茎尖培养中发现,5℃的低温对控制褐变效果十分显著,而且在低温下培养时间越长,褐变越少,但存活率也随之下降,最佳时间为7天左右。温度对试管苗玻璃化有一定影响。文献认为:在10℃~26℃范围内培养的牡丹植株无玻璃苗出现,在26℃~30℃范围内培养,有63%的试管苗发生玻璃化现象,而在30℃以上培养的牡丹苗竟有84%发生玻璃化现象。温度对生根也有一定影响。苹果无根苗在28℃生根最佳,而在21℃和23℃生根率下降,在22℃25℃或29℃对生根无反应。木瓜无根苗,在日温和夜温相对保持在27℃±1℃和25℃±1℃时,生根最佳,若日温降低,根发生速率也降低。日温从22℃±1℃增到29℃±1℃时,根重随之增加,在29℃日温下,根变细,侧根增多。(3)继代培养次数。组培苗的继代次数对生根有一定影响。处于成年期的组培苗生根困难,而处于幼年期状态的和经过多代培养从成年期状态回转到童年期状态的组培苗,生根要容易得多。在苹果富士品种的组培苗生根试验中发现,一般要经过继代培养7代以上,生根率才得以改进。继代培养次数对外植体褐变和试管苗玻璃化也有一定影响。李师翁等在沙棘嫩茎的愈伤组织培养中,及时转移培养材料,继代周期不超过4周,可有效降低愈伤组织的褐变。但继代次数也不可过多,继代4次或5次,则玻璃化频率提高,一般以2~3次最佳。2胚状体的生长和分离愈伤组织的培养细胞处于不断分生状态,容易受培养条件和外界压力(如射线、化学物质等)的影响而产生诱变,从中可以筛选出对人们有用的突变体,从而育成新品种。大量实验表明,从细胞和组织培养获得的遗传变异已成为选择有用变异的一个新重要来源。在木本植物中,具有再生能力的愈伤组织主要由胚外植体得到,而其它部位获得的愈伤组织再生能力极低,这一直是木本植物利用组织培养技术进行植物改良和植物繁殖的一大障碍。李浚明等认为,愈伤组织起初都具有胚胎(或器官)发生潜力,但经过反复继代和保存之后,这种形态发生能力常常下降,有时甚至完全丧失。黄学林等根据愈伤组织的形态将它们大致分为两类:一类是质地较松软、湿润的浅绿色愈伤组织,增殖速度快;另一类质地较致密,表面较干燥,颜色呈黄白色,增值速度慢。关于植株再生的研究中得出的结论:前一种是茎芽型愈伤组织即非胚性愈伤组织,可以通过器官发生途径产生再生植株;后一种是体细胞胚愈伤组织即胚性愈伤组织,可以通过胚状体途径再生植株。当然在这两种类型之间还存在着许多过渡类型。由于胚性愈伤组织具有胚的特征,遗传性状和植株再生能力都优于非胚性愈伤组织,因此,最大限度地获得胚性愈伤组织能快速生产出大量的遗传性状一致的优良株系。许多实验表明,将已获得的愈伤组织进行巧妙的继代培养是获得胚性愈伤组织的必需步骤之一,有时可通过控制培养条件(特别是生长调节物质)和继代的艺术将无形态建成能力的愈伤组织变为有形态建成能力的愈伤组织。能够促成这种转变的控制因子有几种,其中最主要的是植物激素和氮源形态。一般来说,生长素是促使细胞进入持续分裂增殖状态的因子,细胞分裂素是促使细胞进入分化状态的因子,而GA3抑制胚状体的发生。氮源除了供给培养物氮素营养外,还原态氮还具有促进细胞分裂的作用,硝态氮具有抑制细胞分裂的作用。胚状体的发生方式有两种:一种是从培养中的器官、组织、细胞或原生质体直接分化成胚;另一种是外植体先愈伤化,然后由愈伤组织细胞分化成胚。这两种方式中,从愈伤组织产生胚状体最为常见。曹孜义等认为:一般在含有丰富还原氮的培养基上加生长素,尤其是2,4-D来诱导胚状体的发生,然后转移到降低浓度或没有生长素的培养基上使其成熟、萌发和生长。但在木本植物组织培养中,胚状体发生还不普遍或产生的胚状体难以