植物组织培养常见污染及控制

植物组织培养常见污染及控制

自20世纪30年代建立以来，经过70多年的理论研究和技术开发，植物组织培养技术在快速繁殖优良苗木、无病毒苗、育种、细菌资源保存和工艺苗等方面呈现出广阔的潜力和视角。然而，传统的组织培训过程中仍然存在一些不利因素。作者分析了影响的一般因素，如腐败、玻璃化、黄化和变化率高的问题，并总结了其解决方案，以期成为培训专家。1减少组培污染,提高生活质量传统组培过程繁杂的技术环节都是围绕防止污染而制定的,控制污染是组培过程中的首要技术,也是组培研究和工厂化生产中最令人头疼的问题。因此要把污染率降低到可以接受的范围,来提高组培苗的质量和产量。一般而言,组培污染来源分三大类:第一类材料带菌;第二类接种污染;第三类培养过程感染。1.1材料的污染率材料带菌是指原始材料本身带菌,或者继代培养的材料本身带有病菌。1.1.1选择合理的外植体种类、取材的季节、时间、初代接种选取大小适宜的外植体。(1)外植体种类。植物的病虫害、自身带菌不但对植物自然栽培条件下的正常生长造成了影响,而且严重阻碍了组培过程中的大量繁殖速度。因此在组培中应选取带菌较少或不带菌体的材料作为外植体。一般来说,具有块根块茎和鳞茎类的植物由于这些器官长期生长在存有大量微生物的土壤环境中,造成了本身带有很多细菌,故应避免这些材料作为外植体。半夏的组培中选择珠芽为外植体繁殖好于块茎;而一些具有鳞茎的百合类花卉,选择无菌苗、未开放的花蕾为接种材料好于鳞茎。如赵庆芳等在晶体百合组培中发现,选取的材料不同污染率也有所不同,鳞片、花葶、盘茎的污染率分别为28.5%、0、66.0%。(2)外植体的大小。大的材料有较大的表面积,带菌相对较多;小的材料,相应地带菌较少,因而污染率较少。孟杨等在湖北百合组织培养技术研究中发现,接种时分割的鳞片大小不同,污染率也有所不同。0.5cm×0.5cm的鳞片,污染率为5%,0.8cm×0.8cm的鳞片,污染率达到8.3%。1.1.2预处理方法、消毒药剂的种类、浓度、时间及方法。(1)预处理的方法:对母株预处理;改善植株栽培环境;对母株喷布杀菌剂或抗生素。对母株或外植体的预处理:促发新枝;黄化处理;热击;用抗生素进行预培养。邢震等对比野外直接采用外植体和经室内黄化处理的外植体组织培养效果分析发现,经黄化处理的外植体污染率低,但分化率明显没有野外直接采用的外植体高;李群等用48℃的水浴处理材料效果最好,污染率控制到了较低水平,且对材料没有副作用。(2)改善灭菌方法:真空减压灭菌;磁力搅拌、超声波振动;多次消毒(灭菌);使用混合消毒液;灼烧。周俊辉等对玛丽安万年青采用减压灭菌,利用减压抽走植物组织中的气体使消毒剂更易进入植物内部,从而增强杀菌效果,使污染率从对照的93.3%降低到40.0%。郭海滨等将卷丹百合鳞片先以浓度70%酒精浸泡10s再用浓度0.1%HgCl消毒12min,污染率达到65%,而如果先用酒精浸泡30s,再用升汞浸泡15min,污染率可降到15%;王丽娟等在卷丹百合珠芽的组培过程中对接种时外植体的消毒时间做了研究,发现先用浓度75%酒精浸30s,再用浓度0.1%升汞分别消毒3、5、8、10min,最佳灭菌效果为升汞消毒5min。许婉芳等将杀菌剂加入金线莲培养基中,发现50%多菌灵的效果优于70%甲基托布津和25%甲霜灵,其抑菌率达100%且能促进金线莲的生长。(3)在培养基中加入其他抑菌剂。本身带有内生菌的植物,由于细菌潜伏较深,表面消毒方法无法将其消除,初次培养无污染现象出现,但随着继代次数的增加,菌量逐渐累积,污染现象也会随之而出现。黄小荣等认为植物组培中细菌污染的原因是休眠细菌芽孢萌发的结果,她在香水白掌的组织培养中,通过连续添加青霉素,抑制细菌污染,使培养体生长健壮。周俊辉等在万年青茎段培养中,在培养基中加入50mg/L利福平和50mg/L氯霉素,使其污染率从原来的81.55%降低到15.62%,有效防止了外植体的污染。1.1.3切分潜在的带菌材料时,要保证所用的接种工具经过彻底的消毒再去切割其他的健康材料。1.1.4继代培养时,每次继代之前都要对继代的材料进行仔细的检查,污染的材料应给予丢弃。1.2接种室消毒、清洗超净工作台接种污染指接种过程将病菌带入培养材料,可能原因有:无菌室消毒不彻底或超净工作台滤出的空气中带菌超标;交叉污染;操作人员呼吸或身体、衣物上带有杂菌。1.2.1紫外灯接种室消毒,清洗超净工作台。1.2.2接种工具、材料不要与酒精灯、超净工作台铁网面、台面接触。1.2.3接种人员接种时用酒精棉擦手或用浓度为75%的酒精喷洒双手,接种时避免说话,接种的材料、工具不能超出工作台面,接种人员身体应尽量远离台面,接种时应穿上无菌的白大衣,戴上帽子和口罩。1.2.4避免高温高湿天气接种,平时注意无菌室的除湿和熏蒸消毒,必要时用浓度为70%的酒精溶液喷雾消毒。1.3基的污染程度培养过程中环境中的病菌多、湿度大、温度高也会引起培养材料或培养基的污染。1.3.1经常进行清洁卫生,对培养室定期进行消毒处理。1.3.2及时清除污染材料,转移继代材料。1.3.3污染的材料及瓶子要用药液消毒并处理干净,必要时须经过高温高压灭菌后方可使用。2褐褐色问题2.1正式形式细胞受胁迫条件或其他不利条件影响而死亡或细胞发生自然死亡;材料伤口分泌的酚类物质,在多酚氧化酶作用下氧化为醌类物质形成的。2.2影响因素外植体、培养基、pH值、培养条件、其他。2.3解决方法2.3.1褐化的原料一般木本植物的酚类化合物较草本高,组培时木本植物更易褐化;外植体的老化程度越高,其木质素的含量也越高,也越易褐化,成龄材料一般比幼龄材料褐化严重;切口越大,酚类物质的被氧化面积也越大,褐化程度就会越严重;由于植物体内酚类化合物含量和多酚氧化酶的活性在不同的生长季节不同,一般在生长季节含较多的酚类化合物,在取材部位上存在幼嫩茎尖较其他部位褐化程度严重。2.3.2氨基酸pa的使用(1)利用抗氧化剂、吸附剂。抗氧化剂能够阻止多酚氧化物对酚类物质的氧化作用,减少褐变。目前常用的抗氧化剂有硫代硫酸钠(Na2S2O3)、植酸(PA)、抗坏血酸(Vc)、过氧化氢、半胱氨酸等,吸收剂有活性炭(AC)和PVP(聚已烯吡喀烷酮)。抗氧化剂要注意分次使用,应注意有些抗氧化剂会对培养物产生毒害作用,要避免长期在含这些抗氧化剂的培养基中培养,如果先期褐变得到了控制,就应该从培养基中除去抗氧化剂。杨薇红等在亚洲百合接种前用50mg/LVc浸泡外植体2h及在之后的继代培养中加入150mg/LPVP以抑制组培苗褐变现象的发生。张红对库拉索芦荟组培中的褐变现象,培养基中加入活性炭500.0mg/L,环境温度控制在25℃有利于减轻褐变。(2)使用金属螯合剂(EDTA)。由于多酚氧化酶是一种含铜的蛋白质,其氧化活性依赖于铜的氧化还原作用,而金属螯合剂可以把铜离子从酶中螯合出来,形成稳定的螯合物,使多酚氧化酶失去活性。(3)琼脂量的减少、较低的pH值利于减少褐变。(4)培养基中适宜的细胞分裂素浓度可以减轻或抑制褐变。这在很多植物的组培研究中都得到证实,张红在库拉索芦荟组培中的褐变现象及防止试验中也表明,适宜的6-BA浓度(2.0mg/L)对库拉索芦荟的褐变现象有较好的抑制作用。2.3.3不同处理对刺梨制备布花粉的诱导效果试验证明适度的低温、初培暗光或弱光培养可抑制酚类的氧化。陈红等在试验中,低温预处理对刺梨花药愈伤组织诱导有显著的影响,以低温处理3d,花药愈伤组织诱导率最高,褐化率最低。赵伶俐等以蝴蝶兰R4品种叶片为外植体,研究不同时间的黑暗预处理对褐化率、多酚氧化酶(PPO)活性和总酚含量的影响。结果表明,黑暗预处理能减轻褐化。2.3.4高温处理对抗褐变的作用热击处理,采用45℃以上的短时间高温处理能够使多酚氧化酶失去活性,从而达到抗褐变的目的,另外适度缩短继代周期,可以从一定程度上使褐变减轻。3玻璃现象3.1配置机制内源激素失调,能量代谢受阻,蛋白质的正常合成受抑,使分化难以顺利启动,细胞发育异常而致。3.2产生因素外植体材料差异、环境湿度、碳源、无机盐、外源激素、温度、光照、培养基pH值及其添加物等。3.3克服方法3.3.1试苗的百分率刘非燕等在试验中发现,重瓣石竹顶芽产生的试管苗玻璃化百分率最低,基部茎段次之,中部茎段最高。分析这种差异性主要是由顶芽到茎基在内源激素含量和比例上的差异而致。3.3.2培养基的硬度调节培养基的pH值,提高琼脂浓度,玻璃化的比例明显下降。3.3.3培养基化合物提高培养基的碳氮比,降低NH+4浓度或及时转移培养基,在其中加入适量的根本苷、活性炭或聚乙烯醇和青霉素G钾等添加物。3.3.4降低湿度,改善烟气供应状况适当提高光照强度,保持适宜温度25℃(19.5~30℃)利于控制玻璃化,降低湿度(瓶内的空气湿度和培养基的含水量),改善氧气供应状况利于减少玻璃化苗的出现。3.3.5外植体培养基许多报道指出,培养基中外源细胞分裂素供应过多容易导致组培苗玻璃化。如在沾化冬枣的快繁中,培养基中6-BA的浓度为3~5mg/L时,能显著促进外植体发生褐化;在重瓣丝石竹的组培中发现,培养基中高浓度的细胞分裂素,尤其在6-BA为5.0mg/L时,是影响玻璃苗发生的主要原因。3.3.6热攻击处理高于40℃的温度对外植体热击处理可消除玻璃化。4黄化现象4.1生产条件不良培养基中Fe的含量不足;各矿质营养不均衡;培养环境通气不良,瓶内乙烯含量升高;激素配比不当;糖用量不足或长时间不转移糖已耗尽;pH值变化过大;培养温度不适;光照不足等都会造成黄化现象的出现。4.2培养基的使用(1)配制母液和培养基的制作过程中,要检查仪器设备是否准确,还要认真细致地核对每项称量的每一个环节。(2)配制培养基时切记不要忘记加糖。(3)及时转接培养物。(4)使用透气的封口膜以改善瓶内通气状况。(5)适当调节pH值、激素配比和无机盐浓度。(6)控制培养室内的温度;适当增加光照。(7)在培养基中添加抗生素类物质如青霉素、链霉素、头孢霉素等,有时也会出现幼苗黄化现象,应适当减少用量或停止使用。5花物林的选择植物组织培养的重要目的是保存种质资源,避免基因的丢失和毁灭,快速繁殖具有商业价值的花卉苗木。如果培养过程中变异率太高,不仅不能为保存资源和培育优良的品种、类型提供基础保障,还会严重影响工业化生产的组培苗的质量。5.1田间生产基地的选择必须有自己的种源地,而且2~3年换新地以防病原滋生,或在大田生产中寻找远离老种植区、品种来源清楚、无检疫性病害、种植管理水平高的种植区采种基地。通过定期观察筛选出具有原品种典型特征的优良单株,作为组织快繁的原始材料。5.2配合比的控制最佳配方确定以后,不要随意改动。即使根据材料的生长情况需调整配方一些成分的比例或浓度,也只能逐步微调,特别是激素类应避免急增,而且用量控制在安全范围内,配药过程严格操作。5.3附加世代继代增殖的代数对变异率影响因品种或配方的不同而异。5.4诱导愈伤组织再生