转基因大豆遗传转化技术研究进展

转基因大豆遗传转化技术研究进展

大豆来自中国。它不仅是人类最重要的油资源和植物蛋白的来源，也是一个重要的工业材料。它在我国的粮食安全和经济发展中发挥着重要作用。我国大豆种植受自然条件等逆境因子制约常造成减产,同时大豆品种适种范围窄,严重影响优良品种的大面积种植。作物常规育种在提高产量、品质及抗性等方面发挥主导作用,但受有益突变效率和生殖隔离等特性制约,利用有限。而利用转基因技术能把外源抗逆基因(转录因子)引入到作物中,可提高作物抗逆性,被动地提高作物产量。转基因大豆与其他主要作物相比,遗传转化体系不够稳定,有待完善,转化率有待提高。实现此目标,需要以下体系作支持:(1)良好的植株再生体系(受体系统);(2)DNA导入到再生细胞的转化体系(转化方法);(3)良好的筛选系统和稳定的转化效率。国内大豆生产与加工转基因技术自主研发实力不足,存在转化效率低,重复性差等问题,不少研究者针对不同的遗传转化系统进行改进,以期提高大豆遗传转化效率。1中国转移大豆的种植现状及研究1.1以抗草甘膦转大豆为主要的转基因作物国际农业生技产业应用服务中心(Internationalservicefortheacquisitionofagri-biotechapplications,ISAAA)资料显示,1996年转基因作物的种植面积为170万hm2,2011年已达到1.6亿hm2,增长94倍,转基因大豆作为主要的转基因作物,占据全球转基因作物种植面积的47%(7540万hm2)。其中以抗草甘膦转基因大豆(Roundupreadysoybean,RRS)种植为主。由于转基因大豆带来巨大的经济效益,种植规模逐年扩大。近几年,中国转基因作物发展迅速,主要是以转基因抗虫棉为主,但转基因大豆尚未进入商业化生产阶段。1.2国内外细胞转化和基因转换的进展Hinchee首次报道成功获得大豆转基因植株,抗草甘膦转基因大豆(RR大豆)和高油酸大豆(HO大豆)在国际上的种植面积不断增加,转基因大豆类型不断增加。我国研究者主要在大豆抗病虫害、抗逆性及大豆油分等重要农艺性状方面获得转基因植株。徐香玲等将PKT54B7C5上的B、T、K-δ内毒蛋白基因通过农杆菌介导法导入大豆黑农37、黑农39等品种,获得再生大豆植株,并且利用同样的方法将抗真菌的几丁酶基因导入大豆品种东农37号、吉林28号等14个品种,得到转化植株。尹青女等向大豆受体导入热激转录因子8(Heatshockfactor8,hsf8)基因,以加强目的基因hsf70的表达和增加转基因大豆的抗逆性。李小平等采用农杆菌介导大豆子叶节转化法,共获得3株转基因植株。该植株RT-PCR分析表明,rlpk2基因已被成功敲减,并发现敲减大豆叶片中的rlpk2基因,明显改善叶片的光合能力。张秀春等经农杆菌介导,采用子叶节转化法转化大豆,获得一批携带有玻璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的转基因大豆。国内关于转基因大豆的研究绝大多数都是对转基因植株进行抗性标记筛选、PCR检测以及Southern杂交,仅证明外源基因已整合到大豆基因组中。与国内相比,国外不仅具有自主知识产权的载体和像Bt和EPSP基因一样具有重大应用前景的基因,且基因转化和筛选效率比国内高。国外转基因大豆产业化引领世界转基因作物的快速发展。如美国Monsanto公司利用基因枪轰击方法将编码5-烯醇-丙酮酸莽草酸-磷酸合成酶(EPSPS)基因转入大豆,培育出RoundupReady转基因大豆并大面积产业化。相同品质改良的转基因大豆研究也取得重要进展,如转Δ12脂肪酸脱氢酶基因(FAD2-1)大豆,油酸含量达70%,并于1997年获准推广;通过抑制大豆Δ12脂肪酸脱氢酶(FAD2)基因和ACP-棕榈酸硫激酶(FatB)基因的表达,减少种子中Δ12脂肪酸脱氢酶含量,同时控制棕榈酸产量,从而实现富集油酸,获得油酸含量高达85%的大豆新品系并己开始大规模种植。2制备好的转化受体系统大豆遗传转化依赖于高效受体系统和转化方法的有效结合,因此,建立良好的受体系统是实现基因转化的先决条件,关系到基因转化的成败。一个良好的转化受体系统应具备高效稳定的再生能力、稳定的可遗传性、对选择性抗生素敏感、对农杆菌侵染有敏感性以及具有稳定的外植体来源。自转基因技术问世以来,研究者先后建立了许多受体系统:(1)直接分化再生系统;(2)体细胞胚受体系统;(3)原生质体再生系统;(4)愈伤组织再生系统;(5)生殖细胞再生受体系统。随着组织培养技术的不断发展和完善,大豆再生受体系统包括直接分化再生系统和体细胞胚受体系统。2.1不同外植体的分离技术Cheng等首次报道无菌苗的子叶节为外植体,诱导丛生芽获得高频率的再生植株。此外,无菌苗茎尖,成熟胚子叶,幼胚轴以及下胚轴均可作为诱导再生植株的外植体。陈云召等从大豆下胚轴和小真叶离体培养成再生植株。薛仁镐等培养幼胚、幼胚子叶、成熟子叶节、成熟子叶等再次从大豆下胚轴和小真叶离体培养成再生植株。不同的外植体再生频率差异较大,其中子叶节的再生频率较高;并且不同的大豆品种诱导分化芽的能力差别较大,选择再生频率高的基因型、外植体和培养基对大豆组织培养很重要。由于子叶节的再生频率较高,目前常被作为农杆菌介导转化的受体材料,它具有再生时间短、外植体容易获得、不受季节限制、再生过程简单、再生频率高等优点,但运用此法在切子叶节时需要精细的人工操作,且不定芽起源于多细胞,所形成的再生植株有较多的嵌合体,加大后代的筛选难度,同时子叶节受体系统还存在转化效率较低等缺陷,使其应用受到限制。Paz等通过改进子叶节受体系统,以半种子作为外植体,减少切子叶划伤过程,不但简化了试验流程,而且提高转化效率(因品种不同转化效率在1.4%~8.7%,平均为3.8%)。除子叶节受体系统外,直接分化再生系统还包括大豆胚轴和胚尖等受体系统。2.2大豆细胞胚的诱导大豆遗传转化受体材料中的细胞胚主要以未成熟胚的子叶为外植体,经诱导后形成体细胞胚。Christionson等观察到大豆细胞悬浮培养时体细胞胚胎发生,以幼胚轴为外植体,首先获得再生植株。随后Ranch及Lazzeri等对2,4-D诱导的体细胞胚进行较为详细的研究,发现2,4-D诱导大豆体细胞胚胎发生频率高,但形态不正常,难以萌发形成完整植株。而NAA诱导的大豆体细胞胚胎发生频率低,但形态正常,可不经过愈伤组织而直接生成子叶期体细胞胚,说明不同植物激素对体细胞胚的形成及正常生长产生影响。Finer等对体细胞胚胎发生体系进行改进,用于遗传转化,使只有转化部位细胞可以增殖,因而能进行有效筛选,解决嵌合体问题。曲桂芹等通过研究大豆体细胞胚诱导因素发现,除不同植物激素会对体细胞胚产生影响外,大豆基因型、生长素浓度、外植体大小、光周期及培养基中碳源等都对大豆体细胞胚的诱导有显著影响。体细胞胚胎是基因枪转化较为理想的转化受体,为目前大豆转化适宜的受体再生体系。但是此系统再生频率低,诱导出的体细胞胚畸形多,不能发育成正常植株,而且体细胞胚多次继代增殖后,胚性丧失及体细胞变异等问题是影响其用于遗传转化的主要因素,需要进一步研究解决。2.3原生质体再生植株的培养卫志明等首次报道大豆原生质体再生系统,获得愈伤组织并诱导成苗,得到再生植株。随后,罗希明和Dhir等以相似方法获得不同品种的大豆原生质体再生植株。肖文言等经大豆幼胚子叶原生质体培养获得再生植株。这些研究成果证明通过原生质体获得再生植株的途径可行,可为大豆遗传转化受体系统的研究提供依据。但由于原生质体再生频率较低、操作较为复杂、不同基因型差异很大、可重复性差以及原生质体再生植株易发生变异现象等缺点,近年来少有研究报道。3大豆加工方法及微模模式随着转基因作物种植面积的日益扩大,转化技术在作物新品种培育、基因功能研究等领域中的作用越来越大,中国大豆转基因所用的方法包括花粉管通道法、农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、电击法、超声波法等。其中前两种方法应用较多,后几种方法应用较少。国外大豆的转基因方法主要以农杆菌介导法、基因枪法为主;国内主要是超声波辅助农杆菌转化法和花粉管通道法。农杆菌介导法是获得第一个转基因植物的方法,迄今为止,农杆菌介导法获得的转基因植物占转基因植物总数85%,已成为植物基因转化首选方法。3.1农杆菌诱导大豆遗传转化技术农杆菌介导法是指农杆菌侵染植物时,受到植物受伤后释放的酚类物质的刺激,活化质粒上Vir区基因的表达,将质粒上的另一段DNA(T-DNA)共价整合到植物基因组上,在植物体内表达而改变植物的遗传特性。农杆菌介导法的转化效率受众多因素影响,如农杆菌侵染外植体的影响因素、外植体再生能力的内在因素和环境条件(pH、温度和光照条件)等,此法具有流程简单、仪器设备便宜、拷贝数低,且基因沉默少,转移的基因片段长等优点。在大豆中,农杆菌介导法是应用最早、最常用的方法。Hinchee等第一次利用大豆叶盘,获得大豆转基因植株,以子叶节、成熟种子、胚尖和叶柄等获得大豆转基因植株。近年来,研究者通过各种尝试对农杆菌介导大豆遗传转化技术进行改良,如辅助试剂的加入,包括乙酰丁香酮、DTT等硫醇类化合物,以及表面活性剂、AgNO3、bar基因的使用及筛选策略的改变,超声波、针簇和刷子等辅助技术的使用,目前转化效率达3%以上,但各实验室间的转化效率存在较大差异。农杆菌介导大豆遗传转化系统受到多种因素影响,对其影响因素深入研究,有利于提高转化系统的稳定性和转化效率,实现对转化体系的优化和改良。首先是对受体基因型筛选,受体材料不仅必须具有农杆菌易感染性,还需有良好的再生能力。在大豆遗传转化研究中,研究人员筛选出一些适于转化的大面积推广品种。其次是外植体的选择,子叶节、体细胞胚、胚尖分生组织、器官愈伤组织等可作为外植体进行遗传转化,针对不同外植体的转化弱点加以改进,如降低子叶节方法再生植株中嵌合体比例。体系胞胚为外植体的遗传转化方法虽然可以解决嵌合体比例高的问题,但其受基因型和取材季节限制较大,因此有必要大量筛选出适合该方法的大豆基因型。3.2基因枪诱导法基因枪法又称微弹轰击法,是将外源基因包裹在直径1~2nm的钨或金颗粒表面,加速轰击植物外植体靶组织,穿过植物细胞壁和细胞膜而将外源基因带入植物细胞。因此,通过该方法进行DNA的转移过程不受外植体基因型的限制,可以将外源基因转移至几乎所有的植物细胞、组织器官和原生质体中。基因枪介导法在小麦中应用最多,其次是玉米和水稻。优点是不受外植体范围的限制,且载体构建相对简单,但基因枪介导法存在转化效率低、外源DNA片段大小不明确、多拷贝整合比较多、容易发生基因沉默现象等缺点,不利于外源基因在宿主中的稳定表达,而且成本高,操作比较复杂,在实际应用中有一定局限性。茎尖分生组织是大豆中利用此法首次报道的外植体,Mccabe等利用外源DNA包被的钨粉粒轰击大豆茎尖分生组织,获得转基因大豆。体细胞胚系统成为主要的受体系统,利用基因枪介导的大豆转基因报道不断出现。Rech等用无菌水浸泡大豆成熟种子16h获得大豆胚尖,以此作为外植体,利用基因枪介导法进行大豆遗传转化,其平均转化效率高达9%,是目前大豆遗传转化效率最高的研究报道。3.3采用花粉管法转化大豆其他方法由于或多或少存在缺陷,其研究者把目光投向没有筛选基因的转化方法。此外,Liu等利用花粉管法直接把DNA导入到大豆基因组中,获得转基因大豆,其转化效率为3.2%。由于此法将DNA直接导入,而不需要报告基因,目的基因转入也不需要在载体上,因此,不会带入多余的载体骨架,环境安全性好。4抗错误基因的筛选为提高大豆转化率,获得非嵌合体转基因植株,采用一定的筛选策略是植物遗传转化体系中的一个关键步骤。常用的筛选策略有抗性基因的使用、具有表型或生理筛选功能基因(如亚硝酸还原酶NIR基因的应用)和PCR筛选。由于抗性基因的筛选策略可使转基因组织获得竞争优势,降低非转化体的逃逸率、减少嵌合体的形成、提高再生植株的阳性率,因此使用最为广泛。目前,在大豆用于抗性筛选的基因主要有编码抗生素抗性基因和编码除草剂抗性基因两类。前者包括卡那霉素抗性基因(新霉素磷酸转移酶nptⅡ)、潮霉素抗性基因(hpt)和壮观霉素抗性基因(aada)。后者包括草甘膦抗性基因(epsps)、草丁膦抗性基因(bar)、乙酰辅酶抑制抗性基因(ahas)、ALS以及a-tubulin突变基因。除以上两类常用的抗性筛选基因外,在大豆发根中还有利用氨基酸合成酶反馈抑制突变体基因(ASA2)作为选择标记基因。bar基因选择策略的使用是大豆遗传转化过程的进步。bar基因编码草胺膦乙酰转移酶(Phosphinothricinacetyltransferase,PAT),能使草胺膦(Phosphinothricin,PPT)转变为乙酰草胺膦,从而使草丁膦代谢失活。属降解除草剂类系统,对除草剂专一性强,效率高,且对大豆本身生长负效应小,是目前大豆筛选策略中的主流形式。Zhang等通过比较不同浓度草丁膦对大豆转化过程中不同阶段的影响,发现在诱导阶段使用5mg·L