解淀粉芽孢杆菌fzbharpin的构建及防效研究

解淀粉芽孢杆菌fzbharpin的构建及防效研究

harpin是一种通过ii-ii分离系统获得的非微带阳性植物病毒的细菌。它可以诱导植物的抗旱性，促进植物的生长，改善作物的品质。Wei等首先从Erwiniaamylovora中发现了能引起非寄主植物过敏性反应的HrpNEa,进一步研究证明HrpNEa能增强植物的光合作用和提高植物吸收营养的能力,从而促进植物的生长和提高产果率。EdenBioscience公司对HrpNEa进行了深入研究,利用基因工程菌株大量生产HrpNEa,并成功开发出Messengerue4d2生物农药,获得了美国环保局(EPA)商品化或有限商品化生产应用许可。本研究室从Xanthomonasoryzaepv.oryzicola(Xooc)中克隆到了HpaGXooc编码基因hpa1,并利用大肠杆菌表达系统进行了表达,研究结果表明,虽然HpaGXooc蛋白序列与HrpNEa存在很大差异,但是它们具有相似的生物学功能。化学农药的过度使用对环境造成了极大的污染,因此生防细菌和其他一些天然来源的植物材料在植物病害防治和提高作物产量上具有重要意义。当前,国内外将许多具有促生和生防作用的芽孢杆菌开发成了微生物制剂,如国内由南京农业大学开发的生防菌B3和江苏省农业科学院植物保护研究所开发的生防菌株B916分别用来防治小麦纹枯病和水稻纹枯病;国外有德国ABiTEPGmbH公司开发的解淀粉芽孢杆菌FZB42生防促生微生物制剂,美国Gustafson公司和Microbio公司分别将菌株GB03和MB1600开发成微生物制剂。此外,由于芽孢杆菌的蛋白泌出系统非常发达,因此一直被作为表达外源蛋白的重要宿主。缺失了8个蛋白酶基因的BacillussubtilisWB800菌株的改造成功为芽孢杆菌表达系统的研究开辟了新的视野,使许多易被水解的外源蛋白在芽孢杆菌中的高水平表达成为了现实。本研究以具有良好促生和防病效果的根围细菌解淀粉芽孢杆菌FZB42作为出发菌株,将本实验室的Harpin蛋白编码基因hpa1通过同源重组的方法插入到FZB42基因组的碱性蛋白水解酶和中性蛋白水解酶基因位点,进行稳定表达和外泌,并评估了所构建基因工程菌FZBHarpin的促生和防病效果。1材料和方法1.1发酵剂、白叶枯病菌、烟草培养基的制备供试菌株及质粒见表1。解淀粉芽孢杆菌FZB42及其突变体、大肠杆菌TOP10均在LB培养基37℃培养活化;解淀粉芽孢杆菌的遗传转化方法及培养基主要借鉴德国洪堡大学合作实验室方法;芽孢杆菌发酵在Landy培养基中30℃、200r·min-1培养48h,加无菌水将发酵液稀释至试验所需的细胞浓度备用;水稻白叶枯病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzaePOX99在NA培养基28℃培养。烟草品种为‘三生烟’,水稻品种为‘丰优22号’,烟草促生试验所用培养基为植物MS培养基。试验所用抗生素及其浓度如下:氨苄青霉素(Amp)100μg·mL-1,氯霉素(Cm)5μg·mL-1,卡那霉素(Km)5μg·mL-1,壮观霉素(Spec)100μg·mL-1。1.2分子操作过程载体构建过程中酶切反应、连接反应和PCR反应所用的限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNAMarker、Taq酶及Pfu酶购于TaKaRa公司,分子操作过程均按说明书进行。具体引物合成和测序均由德国Martin公司完成,引物序列见表2。1.3pcr检测hpa1转录LB平板活化解淀粉芽孢杆菌FZB42及其衍生菌株。单菌落接入液体LB活化12h后,按1%接种量接入Landy培养基发酵,在发酵24h时收集菌体,利用Trizol法提取总RNA,经DNaseⅠ处理后纯化,反转录成cDNA,用引物Hpa(R)1、Hpa(R)2进行PCR检测hpa1转录情况。1.4对harpin纯化蛋白表达的影响FZB42、FZBAN和FZBHarpin菌株在LB培养液中活化过夜,按1%接种量接入Landy发酵培养基,取发酵液,注射‘三生烟’叶片,以Landy培养基和大肠杆菌所表达的Harpin纯化蛋白(50μg·mL-1)分别为阴性对照和阳性对照,24~36h时观察过敏反应产生情况。试验重复3次,每重复3片烟叶。1.5烟草根系长度测定通过测定植物的生长量(烟草根系生长情况)来反映芽孢杆菌和基因工程菌促进植物生长的效应。具体方法如下:将烟草种子预先在一定细胞浓度的芽孢杆菌发酵液(1×108CFU·mL-1)或灭菌水浸种12h,取出后用15%(体积分数)的次氯酸钠消毒15min,之后用无菌水洗涤直至没有氯气味道为止,然后播种在10cm2、含MS培养基的方形塑料培养皿上,置于25℃光照培养箱中,垂直培养4~5周后观察结果,测定烟草根系(主根系)长度。1.6水稻白叶枯病苗和接种植株高度调查选择饱满水稻种子(品种为‘丰优22号’)于15%的次氯酸钠溶液中消毒15min,用无菌水洗涤直至没有氯气味道为止,将种子置于无菌水中浸泡发芽(25℃,2~3d),待水稻露白后置于芽孢杆菌及其工程菌的Landy发酵液(灭菌水稀释至1×108CFU·mL-1)中浸泡2h,取出种子播种于已灭菌的土壤/蛭石盆钵中,放于温室大棚中。45d后,再次用芽孢杆菌发酵液(灭菌水稀释至1×108CFU·mL-1)喷雾处理植株。发酵液处理后1d,采用剪叶法接种水稻白叶枯POX99,3周后调查水稻白叶枯发病情况和植株高度。每个处理10盆,每盆5株水稻苗,试验独立重复3次。2结果与分析2.1哈普顿蛋白质整合证明载体的构建2.1.1harpin蛋白表达整合载体的构建以FZB42基因组为模板,用引物aprE-1和aprE-2扩增aprE基因及其两侧序列,并进行T/A克隆,构建中间载体pGEMT-aprE;以质粒pM43HF为模板,用引物P43-1(HpaⅠ)和Hpa-2(ClaⅠ)扩增hpa1基因,将片段进行HpaⅠ和ClaⅠ双酶切后与pGEMT-aprE载体连接,构建载体pGAprEH;以质粒pIC333为模板,用引物spe-1-lox66和spe-2-lox71扩增壮观霉素序列(lox-spec),将其以平末端连接方式与经HpaⅠ限制酶酶切的中间载体pGAprEH连接,最终成功构建Harpin蛋白表达整合载体pGAprEHS(图1)。另外,将lox-spec片段以平末端连接方式直接与HpaⅠ酶切的中间载体pGEMT-aprE连接,构建aprE的突变载体pGAprES。2.1.2rpre突变载体的构建利用PstⅠ限制酶酶切质粒pBT2-arcA,并回收lox-km片段,将之与载体pUC18相连接,构建中间载体pUK;以FZB42基因组为模板,用引物nprE-L1-(EheⅠ)和nprE-L2(SphⅠ)扩增nprE-L序列,用引物nprE2274R1(SalⅠ)和nprE3662R2(KpnⅠ)扩增nprE-R序列,将nprE-L和nprE-R分别克隆到载体pUK相应酶切位点,构建nprE突变载体pUNprEK;以pM43HF质粒为模板,用引物P43-1(HpaⅠ)和Hpa-his2,利用Pfu酶扩增hpa1序列,将其与HincⅡ单切的载体pUN-prEK连接,成功构建nprE位点整合载体pUNprEKHS(图2)。2.2复配体的fzban采用芽孢杆菌FZB42的化学转化方法,将构建成功的突变载体pGAprES、pUNprEK和整合表达载体pGAprEHS、pUNprEKHS分别转化FZB42中,经过Km和Spec抗生素筛选,最终分别得到了FZB42含有2个拷贝hpa1基因的工程菌FZBHarpin和aprE及nprE同时被破坏的双突变体FZBAN。提取转化子的基因组DNA,选择抗生素(Km,Spec)和hpa1片段为检测序列,利用PCR的方法检测了所得到的转化子(图3),将完全正确的转化子于15%甘油-70℃保存。2.3pcr扩增检测为了进一步确定hpa1是否能够正常转录,我们采用RT-PCR方法对工程菌FZBHarpin进行了检测。利用检测引物Hpa(R)1和Hpa(R)2,以FZBHarpin反转录cDNA为模板,60℃条件下进行扩增,25个循环;同时,以FZBHarpin的RNA为模板扩增,以检验RNA中是否有DNA的污染。从图4可以看出,hpa1能够在工程菌FZBHarpin中正常进行转录。2.4发酵菌液发酵对烟草hr的影响为了测定表达Harpin的芽孢杆菌工程菌FZBHarpin在烟草上激发HR的能力,我们将测试菌株在Landy发酵培养基中发酵,分别在24、48和72h取发酵菌液,注射烟草。结果显示:在发酵72h后所收集的FZBHarpin发酵菌液,能够像大肠杆菌所表达的Harpin一样,在烟草上激发HR,但出发菌株FZB42及双突变株FZBAN不能激发HR产生(图5)。这表明:Harpin蛋白能够在FZB42中表达,并通过信号肽分泌至胞外在培养基中累积。2.5根系生长作用烟草根系促生试验结果表明(图6):与无菌水和Landy培养基浸种处理相比,FZB42及其衍生菌株都具有促进烟草根系生长的作用。FZB42处理后烟草根长为55.17mm,促生效果达15%;而FZBHarpin处理后烟草根长为64.05mm,促生效果达30%。此外,aprE、nprE双突变菌株FZBAN的促生能力也比出发菌株FZB42有所提高,但比FZBHarpin略低。目前,尚未见胞外蛋白水解酶与促生相关的研究报道,其原因有待进一步研究。2.6fzbharpin和fzban的促生作用为了进一步评估工程菌FZBHarpin的生防和促生效果,我们进行了温室水稻促生和白叶枯病防治试验。结果显示:FZBHarpin和FZBAN的促生作用均比FZB42显著增强,但FZBHarpin和FZBAN之间并无显著差异。FZBHarpin防治水稻白叶枯病的效果最高,达51.9%,与野生菌株FZB42相比,防效提高了一倍,比双突变菌株FZBAN也提高了50%(表3)。3基于hpa1的双刑罚菌株的筛选自1992年发现革兰氏阴性植物病原细菌Harpin蛋白以来,人们在利用其防治植物病害方面进行了多种方式的探索,如蛋白质产物形式和转基因形式。之前,本实验室的Wu等将Harpin蛋白通过穿梭载体的方式在枯草芽孢杆菌OKB105中进行了表达,但因芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒在芽孢杆菌复制过程中容易丢失和转移,这一利用途径受到一定程度的限制。本研究利用同源重组原理将Harpin激发子编码基因整合到根围促生拮抗解淀粉芽孢杆菌FZB42基因组中,从而有效解决了穿梭载体丢失和转移给环境造成的基因漂移危害,使有促生防病效果的Harpin蛋白和生防芽孢杆菌真正结合起来,创制出功能多样性的生防制剂。本研究选择将Harpin编码基因hpa1分别整合到FZB42的碱性蛋白水解酶编码基因aprE和中性蛋白水解酶编码基因nprE位点,成功构建双拷贝Harpin外泌工程菌株FZBHarpin。之所以选择整合在这2个位点是因为这2个水解酶是胞外蛋白降解的主要作用因子,在它们正常表达情况下,可能会将分泌到胞外的Harpin蛋白降解,使得其生物功能不能完全发挥出来。工程菌FZBHarpin发酵72h后,其发酵液可引起烟草过敏性反应,这进一步表明Harpin蛋白可以外泌在发酵培养基中并且保持生物活性。烟草根系促生和温室水稻白叶枯病防效结果显示,工程菌FZBHarpin具有比出发菌株更好的促生和防病能力。