儿科基因组学在罕见病中的应用

儿科基因组学:在儿童罕见病诊断中的应用CarolineF.Wright,DavidR.FitzPatrick andHelenV.Firth摘要|很多罕见病都累及儿童， 且这些罕见病患儿的发病情形多数是由于潜在的遗传因素所导致的。然而，利用当前的知识和技术对这些罕见病进行分子诊断仍是一项挑战。儿科基因组学通过将新一代测序技术，特别是全外显子组测序 （WES）和全基因组测序 （WGS）技术，应用到该领域的研究及临床实践中以攻克这项挑战，目前其尚处于一个发展不甚成熟但进展非常迅速的阶段。这种复杂多学科的方法，结合不断增加的人群遗传变异数据，已经大幅提高了致病基因的发现率，并促进了儿科罕见疾病的诊断。重要的是，对于受累家庭，一种更好地了解罕见病遗传基础的方法，能够转化成更精准的疾病预后、管理、监测和遗传咨询，并促进新疗法的研究，和提供更好的医疗支持。罕见病被定义为，在普通人群中发生率低于 1/2,000的疾病。由于罕见病通常会对生殖适合度产生不利影响，故而这类疾病在一般人群中很少见。目前约有7,000种罕见病，其中〜80%被认为是由于遗传因素所导致。多数（50-75%）罕见病累及儿童，且很多是具有一系列表型、累及多系统的严重疾病（FIG.1）。从整体来看，这些疾病是儿科住院患儿的重要病因，35%的这些罕见病患儿在1岁内死亡；1/3的先天罕见病患儿的生存期将不超过5年虽然近1500个基因的罕见变异已被证明可导致发育障碍性疾病（developmentaldisorders ），但仍有许多致病基因有待被发现。精准诊断一一这里被定义为识别出可解释罕见病临床特征（表型）的精确分子致病原因（基因型）一一是安全医疗实践的基础。对于罕见遗传病的患儿们来说，一种可靠的基因诊断方法，不仅为其得以利用医学文献中的丰富信息提供了钥匙，这些文献信息提供了疾病管理和治疗方面的建议，还有可能使其接触到特定疾病的支持群体，使这些罕见病家庭不再孤立无援。强有力的基因诊断也能够精确测定家庭成员目前和未来的患病风险。然而，因这些疾病的基因和表型的多变性以及因我们认识的局限性所致，对每个个体进行精确诊断仍然是一个相当大的挑战。为应对这一挑战，国际罕见病研究联盟（International RareDiseasesResearch Consortium,IRDiRC）最近发出了2017-2027未来十年的愿景： “让所有罕见病患者在就医的第一年，都能够得到精准的诊断、关怀，以及尽可能的治疗资源”。致病性基因变异的范围，从变异大小来说，可以从单个碱基对的替换、缺失或重复，到基因结构变异，乃至整个染色体拷贝数的改变（非整倍体），或基因组拷贝数的改变（例如二 /三倍体嵌合）。不仅由这些变异单独导致疾病的情况非常罕见或极罕见（V100,000），而且通常还存在由于疾病外显率差异以及同种疾病不同患者的表现度差异所呈现的临床表型的多变性。这种遗传病的多变性部分甚至全部（在极端条件下）可归因于基因座异质性（locus heterogeneity ）和等位（基因）异质性（allelicheterogeneity）；例如“智力障碍”的临床特征，可能是由一个或多个（＞700个）不同基因的单个等位基因变异或双等位基因变异引起的。其他导致遗传病多变性的原因还包括一个基因或多个其他基因（修饰）的多个遗传变异和环境因素，但目前我们对这些因素很难进行识别和量化。因此，大多数罕见遗传病并不具有高度特异性的临床表型，并且临床上通过经典方法难以诊断，所谓的经典方法，即依赖于临床表型模式一致性的识别，如发育异常、特异部位的畸形以及特征性面容等表型的组合。此外，并不是所有儿科罕见病病因都归因于遗传，在世界范围内仍有很小一部分但非常重要的原因是由于致畸物的接触（如胎儿酒精综合征，先天性弓形虫病或兹卡病毒感染）。因此到目前为止，大多数罕见病患儿，尤其是发育障碍的患儿，仍未得到确诊。新一代测序技术（NGS）大大提升了获得基因诊断的预期，因为在用这种方法时，这些患儿的基因型和临床表型是不可知的。对基因组中每个基因同时测序，能检测出个体基因组中存在的绝大多数可能致病的基因变异，使得跨越一系列复杂的儿科临床表型进行诊断成为可能（ FIG.1），甚至对于罕见和极其罕见的病例，包括那些儿科临床医生可能都很陌生的罕见病，也可望得到诊断。一旦某综合征的遗传基础得到确认，其被发现的临床表现往往会增多（称为综合征扩张），因为我们已经认识到，相同的分子遗传基础可以表现为轻微表型或部分表型的组合。基因组检测技术的进步对儿科罕见病有着特殊的影响，与成人罕见遗传病相比，儿科罕见病因其早期发病以及致病变异性质和发生频率的差异，意味着诊断阳性率通常会较高。严重发育障碍性疾病的生殖适合度通常很差； 没有强大的平衡选择（相对罕见），或受到社会上和/或地理上隔绝的婚配的影响（相对常见），这类疾病的基因变异在人群中难以传代维持。因此，严重儿科遗传病的致病

变异预期应该是极罕见变异和往往是新发 （denovo）变异（显性遗传模式）或在近亲婚配人群或奠基者人群中富集的变异（隐性遗传模式）。尽管人类基因组在不同的个体之间存在大约 400万至500万个的多态性变异位点，但这些变异位点绝大多数是常见且良性的变异。那些罕见危害性新发变异（和双等位变异的组合）不太可能出现在成人对照群体中，故儿科罕见病的基因诊断可以由此而简化。PubMed文献识Figurel|各类儿科疾病利用全外显子组测序 （WES）的诊断率（基于文献报道） 上图中给出了每个表型类别的全外显子组测序的诊断率和相应的别号（PMID）;仅采用了病例数》10PubMed文献识病基因的致病性或可能的致病性变异。除了神经发育障碍性疾病以外，其他许多种类的疾病缺少相应的研究报导。上图中图框的大小与在儿科临床实践中统计的疾病表型流行率大致成正比。本文主要综述了基因组学在儿科罕见病诊断中的应用， 不涉及肿瘤的体细胞变异或基因组学在儿科癌症诊断或管理中的应用。我们首先概述了从传统的基因诊断检测转向NGS检测的益处。接着，我们着重讨论了数据分析的一些问题，并认真考虑了全外显子测序（WES）或全基因组测序（WGS）在目前临床上应用的主要适应症。最后，我们从工作流程的改进、更广泛的应用和治疗机会等三方面讨论了儿科基因组学的未来。从基因检测到基因组检测分子检测和全基因组细胞遗传学检测的优点 分子检测和全基因组细胞遗传学检测的优点 (FIG.2a)传统的基因检测。在过去，临床遗传学主要依赖两种类型的基因检测：高度集中于分子区域的高分辨率的单基因检测和全基因组低分辨率的细胞遗传学检测（FIG.2a）o在单基因分子检测中，根据患者的临床表现选择特定基因进行Sanger测序或基因分型。通过这种检测得到确诊的概率， 取决于医师正确识别病症的潜在遗传病因，并选择正确的检测方案。因此，单基因分子检测最适合用于诊断由一个或少数几个基因突变导致的高度特异的临床表型。例如，大多数“经典”遗传病是用这种方法进行诊断的，如囊性纤维化（由CFTR变异引起）或Duchenne型肌营养不良症（由DMD变异引起），而低分辨率全基因组检测方法，例如 G显带显微镜核型分析（分辨率约为5-7Mb），可以用于诊断常见的三倍体异常和染色体部分结构非整倍体异常，还包括一些明显散发的发育障碍性疾病，后者往往由于染色体部分结构发生了罕见的重复或独特的大片段的不平衡所导致。较小一些的结构性变异，例如拷贝数变异（ CNVs），可以通过基因组微阵列的方法来进行分子核型检测，这种方法的分辨率通常可达 50-100kbo基因组微阵列可检测到基因组中任何位置的致病性 CNVs，包括与微缺失和/或微重复综合征相关的重复发生的变异。然而与 NGS相比，这些检测技术诊断敏感性较低，仅能诊断出约 10%的儿科罕见病患儿。现代基因检测技术。NGS技术能够对多个基因，进行大规模的平行测序，这使得临床遗传学发生了革命性的变化。临床医生现在可以要求同时对多个基因、甚至全外显子组或全基因组进行测序，而非仅仅选择对单个基因或单一类型的变异进行检测。这种高分辨率的全基因组检测方法结合了单许多儿科疾病是由众多不同基因中的一种基因变异引起的，因此，对多个基因同时测序可以进行快速且全面的分子遗传学分析。举例来说，Bardet-Biedl综合征可能是由20多个基因的变异引起的，其临床表型难以区分；同样，先天性感音神经性听力障碍的致病变异也有很多，其在临床上难以区分，但在分子遗传学上却存在显著差异。针对这些情况，对所有已知的致病基因同时进行检测将能改善并加速诊断进程。NGS对于可能由基因组的上千个基因的任何一个的单核苷酸变异（SNV），或小的插入和/或缺失（indels）导致的罕见发育障碍性疾病的诊断特别有用。依次地检测每个候选基因已不再是可行的方法 （FIG.2b）。以NGS应用于婴儿型癫痫性脑病的基因诊断为例，婴儿型癫痫性脑病是可由数十种基因中的任何一种基因变异导致的一类异质性疾病，在 NGS的驱动下，该疾病在2012年至2015年间已发现和鉴定出 31个新的致病基因。NGS技术检测SNVs和indels的敏感性非常高，虽然 Sanger测序仍被许多实验室认为是金标准，但实际证明 NGS技术可能更优越，尤其是在检测杂合性变异和嵌合体变异方面，杂合性变异是指目标变异仅出现在染色体对中的一个拷贝上，嵌合体变异是指仅在个体中部分细胞亚群中出现的变异。（译者注：这里对Sanger测序和NGS的比较性论述非常关键， Sanger测序的敏感性存在局限， Sanger测序验证时常会对NGS检出的杂合变异和嵌合体变异给出假阴性的结果 ）NGS数据也可以用来检测 CNVs和其他的结构性变异，尽管在这方面NGS分析的有效性目前还落后于微阵列。然而 ，经过优化的基因panel采用NGS深度测序对于检测小的外显子缺失 （v10kb）已证明非常有用，而

这部分变异往往容易被低分辨率微阵列检测所遗漏，同时WES和WGS两种方法均已成功用于检测大的 CNVs（>WES和WGS两进行WES或WGS检测之前，是否进行基因组微阵列检测的冋题目前尚未解决，因为各个检测的敏感性和特异性取决于所选择检测方法的特性、分析流程的部署以及对不同大小 CNVs的诊断率。虽然NGS技术能对基因组上每一个基因和每一个顺式调控元件（CRE）进行测序，但儿科临床报道通常关注那些已知与儿童期发病的罕见病相关的基因的变异。然而，基因组中约 70%的基因和几乎所有的 CREs在人类健康和发育中的功能仍然未知，因此可能导致疾病的许多变异通常不会被报道，因为这些变异在分析时出现在未知疾病相关性的基因上。此外，短读长的NGS无法可靠地检测出三碱基重复扩增，而这涉及到儿科疾病如脆性X综合征、先天性肌强直性营养不良和 Friedreich共济失调等疾病的诊断。另外，NGS对小片段CNVs的检测通常表现也较差，如外显子缺失或重复的检测，这是某些疾病如杜氏肌营养不良 和脊髓性肌萎缩症（SMA）1型的主要致病原因。合子后的嵌合体变异在低覆盖率的检测数据中经常会被遗漏，这类病例中受累患儿经常是 denovo变异引起的，也有可能遗传自未发病的嵌合体的父亲或母亲。因此，至关重要的是要回顾审核每份报告可能缺失的数据，并确定检测和 /或分析是否覆盖了所有相关基因，和是否检测了通常与该疾病相关的所有变异类型。 （译者注：这里提到了 NGS在检测小型变异和大型 CNV方面的优势，及其局限性。值得注意的是，NGS对于中等片段CNV，例如连续几个外显子缺失/重复的检测，已有些实验室和研究组做了探索并取得了积极进展）

基于新一代测序技术的诊断检测。 NGS用于临床诊断的策略有很多种， 根据测序靶标区域数量和类型的不同而不同。靶标检测方法，包括对完整的单个基因进行测序，例如之前已经对单独变异进行过基因分型的疾病；对疾病特异性基因进行测序，检测范围从2至〉2,000个基因中组成的不同大小的基因检测panel;对目前与单基因疾病有关的约 4,000个基因的所有外显子进行测序，这也被称为临床外显子组或孟德尔组（ Mendeliome）。相比之下，通过WGS对WES和整个基因组的所有约 20,000个蛋白质编码基因进行的测序本质上应属于非靶标检测。所有基于 NGS的诊断方法都会生成大量数据，但不同检测之间的数据量的差异可能很大，从一个小基因的几百个碱基对，其中仅含有少数变异的数据量到整个基因组 30亿个碱基对每个人约有4-5百万个变异的数据量 （FIG.2c）。随着平行检测的基因数的增加和产生数据量的增多，检测的敏感性也随之增加，而检测的特异性将会降低，并且来自后续法律和伦理的挑战将会增加 （BOX1）。尤其是关于如何处理未经许可的二次分析的问题，由于每个基因组中数量庞大的变异信息和其应用范围的广泛性， 这个问题是非常有争议性的。 WES或WGS为各种疾病的基因组筛查提供了机会，但对于过度诊断的合理担忧，已经促进在不同的实验室和不同的管辖区内实行了不同的替代性方法。在应用虚拟基因panel的方法分析WES或WGS数据时，需要在以下二者间求得平衡，即 panel范围的设定是限定在与患者特定表型直接相关panel在临床上是非常panel在临床上是非常有吸引力的，因为它减少了目标外冗余数据及预期外结果的可能，但由于遗传的异质性，其应用极易导致漏诊。然而，每个个体中存在的良性遗传变异的数量，以及每个基因组数据64的解读潜力意味着过度解读导致过度诊断的可能性是相当大的，且这种情况的出现随着检测的范围的增大而增加。目前尚不清楚如何最好地调整基因组的分析，以达到最大限度地识别真正的致病性变异，尽量减少对误导性变异的识别。一般很少对特定检测的灵敏度和特异性进行记录或比较，因为这些结果取决于许多因素，包括患者是否最终确诊、所讨论表型的基因组证据，以及来自正常人群的对比数据的可用度。在临床实践中，检测数据之间并不能常规地进行互相比较。先证者模式和Trios家系模式的检测。对WES或WGS检测得到的分子遗传变异进行分析的一个很好的策略即是使用家系 Trios模式分析患儿及其生物学父母的样本。这使得良性的家族罕见变异可以被过滤掉，仅出现在患儿身上的新发变异可以很容易被识别，隐性疾病或印记疾病的变异状态可通过遗传模式进行确定。对于父母双方都没有受到与孩子同样疾病影响的家庭，父母-先证者（Trios家系模式）的测序分析比单独孩子（先证者模式）的测序分析，可以减少大约十倍的候选变异数，并提高了 50%的诊断率（FIG.2c）,从而大大提高了达到精确诊断的可能性和加快了达到精确诊断的速度。需要对这种分析效率的提升与其所带来的患者父母测序额外成本的增加进行权衡，但是其所增加的费用成本，往往被需要共分离家系验证分析的候选变异数目的减少而抵消，而这种共分离验证对于先证者模式却是必不可少的。 （译者注：随着测序成本的下降， trioWES的成本逐渐降低，在中国已出现了和Panel价格倒挂的情况，从而更加凸显了trioWES的价值）。对于使用常规基因检测无法诊断的、表现为严重发育障碍的患儿进行Trios模式（标准家系，即先证者及其父母共三人） WES筛查，目前诊断率约为40%,而在所有基因检测方法中，该模式对这些表型多样、难以解决的疾病的总体诊断率超过 50%。Figure2|临床上的遗传异质性与基因组检测策略。a|应用于临床遗传学的基因组分析方法，从使用光学显微镜观察染色体进行基因组拷贝数分析的传统方法，发展到全基因组测序。 随着检测分辨率的提升，可检测到的变异数量也随之增多。虽然能检测到的变异数量的增加可以提高各种疾病的诊断阳性率，但同时也大大增加了检测到偶然发现和临床意义不确定的变异的可能性。b|疾病表型的特异性越低，其越可能由很多个基因的变异导致，即遗传异质性随着表型特异性的降低而升高。如果疾病的表型和/或遗传同质性很高，则对单个或少量基因进行检测可能更为适当。而在表型和 /或遗传异质性较高的情况下，可能需要对数百上千的基因进行检测，这样平均每个患者将有数千个基因变异的检出量。全外显子测序（WES）和全基因组测序（WGS）是表型未知情况下的最佳检测策略，可用于诊断各种疾病。c|需要在测序策略的诊断潜力和其实用性与成本之间寻找平衡。 如图示，目前已报道的通过不同 NGS方法检测的先证者数量绘制于 X轴，所覆盖的基因组百分比用Y轴loglO的值表示，诊断率则来自公开发表的文章。利用 Trios策略的WGS诊断阳性率最高，数据信息量最大，但其费用也最高，因此可参考的相关报道很少。鉴于目前已知的致病性基因变异大多位于基因编码区，在严重智力障碍疾病的诊断中， WES策略相对WGS仅在诊断阳性率上有少许降低(从约42%降到40%)，但检测的费用成本大大减少。另一方面，虽然用仅对先证者进行检测(proband-only )的策略取代核心家系(trio)策略是可行且经济的，但代价是诊断阳性率的显著下降 (译者注：从trioWES的40%降低到先证者模式WES的仅约28%)，这主要源于新发 denovo变异和等位基因的反式杂合变异往往不能通过仅先证者检测的模式( proband-only )直接判别。对基因 panel或单个基因的NGS测序是最常用的方法， 但是诊断率很大程度上依赖于对表型和患者的考察。这取决于临床表型同某种可检测的基因变异之间的相关性和有多少比例的该疾病表型的患者可以用该疾病已知的致病基因来解释。 (见FIG.1)。N/A表示不适用。PartbisadaptedfromtheJournalofMedicalGenetics,Boycott,K.etal.,52,431 F37(2015)withpermissionfromBMJpublishinggroupLtd.(REF.62).PartcisadaptedfromREF.167,MacmillanPublishersLimited.数据的整合与解读在过去的十年中，越来越清楚的是，个体基因组的信息不能单独被解析。需要了解群体中出现的背景变异以过滤常见变异。理想情况下，这些信息来自随机抽样的个体，并且这些个体没有通过任何特定的临床或社会特征来进行选择，需要成千上万个这样的基因组，对变异进行提取、注释和解读。最佳的变异分类，还需要检测个体详细而全面的临床信息，而不是简单的诊断标签。WES和WGS数据量之大，需要自动化的变异过滤，从而可以集中处理与临床相关的基因组区间和 /或变异特征。 用于诊断罕见病的分析工作流程尚未完全标准化，因为实现强大基因诊断的工作流程环节包括原始数据的处理、致病性变异的识别、临床数据的整合等 (FIG.3)，是非常复杂的且仍在不断发展完善中，且因为每一步都有其自身的问题需要进行个体化的评估。变异的提取和注释。 变异的提取和注释涉及高度复杂的过程，使用同一流程对同一WGS样品进行重复分析，其重复性一般小于 100%。变异提取通过将数据中表示的每个位置与参考基因组中的等同位置进行比较，从而识别出个体等位基因碱基组成的差异。提取的灵敏度取决于检测数据和参考数据的质量及所采用的算法。低质量或低覆盖率的数据会导致输出结果中重要变异的丢失。在重复序列中进行变异提取是非常难的，尤其是对小的插入缺失，这也会导致错误的诊断，尽管变异提取过程发生在原始数据处理阶段。变异提取数据通常保存在标准化的VCF(VariantCallFormat,VCF) 文件中，该文件通常被修改包括对每个变异进行注释以用于临床分析。一些注释对于临床解读来说是非常关键的，尤其是次要等位基因频率(MinorAlleleFrequencies ，MAFs)和变异危害性预测。所有的注释，除了MAF数据， 都会随着注释时所使用的数据和软件工具而变化。因此，尽管具有标准化的结构，来自相同的数据的 VCF文件在不同的提供者和不同的版本之间会有很大的差异。Box1 |儿科基因组学的伦理、法律和社会影响儿科基因组学同样存在临床遗传学几十年来一直面对的许多伦理、法律和社会问题，例如对生殖自主权、科研项目的知情权、双亲关系的隐私以及对家庭成员的影响 。然而，基因组数据量的巨大和广度还带来基因检测本身的新问题，这对儿科检测来说更为复杂；儿童缺少是否接受检测和/或研究的自主权，这意味着在决定什么最符合患儿的利益方面，父母和临床医生起到更重大的作用。基因组学时代的绝大多数新伦理问题都与数据的存储、解读和使用有关。数据存储。由于临床级别下一代测序（ NGS）数据的大小，及对其分析所需的计算能力，应该如何以及在何处存储这些数据尚不清楚。此外，不清楚谁可以利用，或是什么时候应该允许利用这些数据。例如，医疗记录是应该仅包含用于诊断的变异，或是所有潜在的临床相关变异，或是所有检测到的变异，还是应该包含全外显子组或全基因组序列？若是亲代基因组已经作为Trios家系策略的一部分进行了测序，那么家系数据应该如何以及在何处存储？数据访问是应该只限于参与直接服务于该家庭的临床医生，或也向工业界和 /或学术界的研究人员开放？尽管具有基因组序列的个体在未来几年内可能在数据重复分析中获得临床益处，但是不断发展的测序技术可能意味着，如果临床指征明确，那么简单利用新的测序技术对其基因组进行重新测序，可能比起数据存储来说实际上更便宜、更简易且更具临床应用的信息价值。数据的保密性与利用。 NGS检测得到初步结果后，必须要在保护患者个体隐私和广泛数据分享以完善变异解读（为了患者个人或其他患者的利益）之间进行微妙地平衡。在儿科中，这种平衡更加复杂，父母经常被要求对孩子的基因数据做岀决定，而这可能会造成不可逆转的影响。当孩子接近或超过法定年龄时，这些决定是否应被重新审视？关于谁能访问这些数据的问题，不仅涉及到诸如家庭成员、临床医生和研究人员等个人，还涉及到他们可获得数据的范围。问卷数据表明，父母对数据分享未来对他们的孩子带来风险的问题上，比成年患者更为关心。对数据的使用权限，可能限于特定诊断的基因变异， 或是一系列临床相关的结果，也可能包括整个测序序列。对此，我们在之前提出过一种平衡数据深度和共享范围的比例方法。这种方法包括完全公开共享有限数量的潜在致病变异，从而最大限度地发挥诊断的潜在益处，同时最小化个体可能被重识别的风险。尽管共享个体全外显子组或全基因组数据也很重要，但个人被重识别的可能性要高得多，因此实际中经常使用具有严格管理访问权限的数据库来管理数据。共享匿名且有限的表型和基因型数据，不仅可以增加诊断和新发现的机会，而且还将增加极罕见病情的患者参与到新疗法的研究或临床试验的机会。医疗服务的责任。对于临床医生来说，数据的访问问题与他们的医疗职责是否仅限于为患儿的直接问题进行诊断，或是否超出了初始检查的范围有关。这项医疗责任可以延伸到当新知识被揭示岀来时，定期对数据进行再分析，有可能在最初测序的多年后才能对患者进行确诊，或者根据新证据来纠正之前的误诊。一些研究已经开创了一种定期更新基因 panel进行迭代报告的方法，基于目前发现新基因的速度，这或许在儿科中产生实质性的诊断获益，尽管如此，但在临床中对基因组数据进行常规重新分析却受阻于用于更新和重新分析数据的资源不足以及需重新联系患者等情况。医疗服务的职责还可以扩大到寻找倾向于成年发病的情况以及患儿及父母的不良药物反应的偶然发现。美国医学遗传学和基因组学协会推荐，应在检测数据中积极查询额外的“Ooked-for”的发现，尽管目前仅限于 59个基因的致病变异。一般情况下，不建议对儿童进行无早期治疗的成人发病的疾病的额外查询 ，迄今为止，英国和欧洲的遗传学会一直在试图扩大基因组分析的范围，而非仅仅是寻求诊断。遗憾的是，解释无症状家族中可能的致病变异通常是困难的，因为大多数疾病基因已经在具有特定病症的个体或家系中被发现；因此，机会性基因组筛查(opportunisticgenomescreening )的益处和危害目前还不清楚。Figure3|运用二代测序技术，整合临床和实验室的工作流程，用以优化罕见病的诊断。儿科基因组学服务的安全、有效的实施，需要精心的设计，以优化临床医师、生物信息学家以及科学家在诊断流程中各个部分的专业建议。变异筛选过程的每个步骤都必须谨慎考虑和充分评估，因为致病变异可能在任何步骤被疏忽筛除。尽管如此，仍需要严格的筛选使变异数量降到足够低的数量以供专家审核。通常次要等位基因频率 MAF>1%或甚至〉0.1%的变异会被筛除。需注意的是以下可能造成致病变异丢失的情况： 选择了错误的基因转录本， 在trios家系分析中误判了遗传模式（比如，表型轻微的父母被记录为表型正常），或者造成罕见病的变异类型在测序中或在检测流程中未能很好的捕获和检测（例如三碱基重复变异导致的疾病，如脆性 X综合征）。对患者的临床评估发生在诊断的开始和结束。在开始阶段，临床评估用于确定患者的临床表现存在可检测的遗传基础的先验可能性，以及用于确定临床表型和建立临床鉴别诊断。最后，临床医师应当评估实验室所提交的候选变异，能否构成明确的遗传病诊断（完整的或部分的诊断），以及诊断是否足够可信，得以指导患者未来的临床诊疗，并指导其亲属检测或胚胎植入前检测和产前诊断。在一些疑难病例中，罕见的候选变异常由临床专家和遗传专家组成的多学科小组会诊予以讨论（见 FIG.4）。ACMG，美国医学遗传学与基因组学学会； HPO，人类表型本体。（译者注：图示将流程划分为实验室和临床两部分，并且这二者是有机联系的，尤其是实验室需要基于临床表型信息进行分析，临床医生需要对基因数据结合临床进行评估。目前国内已有面向医生的诊断云平台系统，医生得以参与到检测报告数据的审核以及与实验室的互动沟通 ）变异的过滤。关于将哪些变异纳入到诊断评估体系，哪些变异从后续分析中排除，在很大程度上取决于所使用的资源和访问日期。如果变异没有预测性的或已知的功能改变，或是被认为是太常见而不能成为特定疾病的原因，或者因为它们不符合所观察到的疾病的遗传模式，则这些变异通常会被排除(FIG.3)。如果使用Trios模式，则在对父母进行表型评估时需留意，以确保他们没有与患儿疾病相关的轻微的亚临床表型，否则会指向错误的遗传模式，从而混淆分析。过滤掉不具有已知功能的变异需要通过诸如EnsemblVEP或SNPeff的软件准确预测基因变异的危害性影响。 但是,这些预测可能并不能反映一个变异的真实的生物学危害性意义。此外，由于存在可变剪切体，相同的基因组变异可能具有不同的预测性结果，且缺乏一种简单的选择方法来确定大多数基因的临床相关转录本，这是不同诊断实验室之间差异的重要来源。识别常见变异需要访问具有大规模的人群资源数据信息的数据库，如 ExAC数据库和gnomAD数据库。在撰写该综述之际，这些数据库已包含了来自一系列成人研究队列的超过 12万个外显子组和15,000个基因组的变异数据，尽管许多种族人群数量仍然不足。导致严重儿童疾病的基因变异很少出现在成人疾病群体或其对照组的致病构型中，并且对早发型疾病来说，生活方式因素和长期的环境暴露不太可能导致其实质性的疾病多变性。因此，可以使用非常严格的等位基因频率阈值来筛选非常罕见的变异，用于患儿变异数据的进一步分析。然而，测序个体的种族以及其种族在参考数据库中的代表数据收录的情况，可能会影响变异过滤的有效性，且在基因组分析中仍然存在着欧洲偏倚( Europeanbias)。Figure4|基于表型的变异评级和解读的多学科小组评审 。两种互补的方法（临床和统计学）可用于基于表型的变异评级。 a|临床方法中，经过变异致病性、人群中出现的频率和遗传方式进行筛选后保留下来的变异，应参考患儿的临床表型来进行评估（译者注：即为生物、遗传、临床三要素分析） 。这项工作最好在多学科专家小组的协助下进行，专家组对患者的临床表现、家族史、相关病史和其他检查结果（比如生化检查和影像结果）进行回顾，参考某个特定基因相关的临床特征的可用汇总数据（如FIG.4b）和已报道的文献。分子诊断提示的候选结果可能需要新的数据（比如家系分析、进一步的临床检查或者对患儿信息的重新调研）来确定结论和进行可靠的基因诊断，或排除一个无法解释患者表型或家系遗传方式的基因变异结果。 在部分患者中，变异是否致病并不能得到明确的结论。 b|表型匹配的统计学方法需要一定数量的在同一基因上存在致病变异的其他个体和目标患儿的分类的、定量的和/或基于影像的表型信息。这些数据可以用统计学方法对患儿表型与疾病模型匹配进行量化，并与其他不相关疾病的模型匹配进行比较分析。随着被基因诊断确诊的罕见和极罕见遗传病的患儿越来越多，这个方法将越来越可行。 BWt,身体体重；DQ，发育指标；HPO，人类表型本体；Ht,身高；OFC,枕额周长/头围；Wt，体重。（译者注：BWt应为出生体重，Birthweight。应为原文错误）致病性判断。临床检查是否全面详尽，对于解读基因组测序鉴定出的候选变异和保持良好的临床实践仍然是至关重要的 （FIGS3,4）。对自动化流程筛选出的罕见变异进行致病性判断和确定基因诊断，是极具挑战性的。以往与所述疾病有关的基因变异通常通过设定基因 panel进行优先考虑，并且鉴定出由非众所周知的致病病因导致的患者，有助于鉴定新的致病原因。然而不幸的是，文献中常常出现假的基因 -疾病关联关系，这导致了基因panel之间的巨大差异，而且关于依据何种证据水平将某个基因纳入一个基因panel中，尚缺乏明确的共识。此外，用于临床的致病性变异数据库，如HumanGeneMutationDatabase (HGMD)，里面有大量错误,导致很多良性变异被错误的选中而形成貌似可信的诊断。随着基因组测序数据的增长，这种情形有可能会得到改善，但像 gnomAD和ClinVar这类包含健康人群及罕见病人群的基因组大数据集，其重要性是不应被过度夸大的。儿科的大型队列研究，例如英国破译发育障碍性疾病的研究( DecipheringDevelopmentalDisordersStudyintheUK )，从统计学意义上建立了仅基于基因组数据判断致病性的可靠方法。该研究同时也参考了表型数据的分类和定量。分类方法使用结构化的分类法，例如人类表型本体( theHumanPhenotypeOntology ，HPO),用以获得重要的临床特征，同时儿科遗传学的量化数据则包括生长发育关键节点的数据。美国医学遗传学和基因组学学会-分子病理学协会(AmericanCollegeofMedicalGeneticsandGenomics-AssociationforMolecularPathology,ACMG-AMP)指南的出版是朝着建立变异分类的通用框架迈出的重要一步，且这一框架将持续被完善。 DECIPHER之类的平台帮助临床医生进行标准化表型的捕获，并将其与基因型整合为单一资源内的患者级数据记录，从而能够对相关数据进行全面的探索分析。 DECIPHER显示表型信息、成像数据、基因型信息(包括变异型，如 SNV或CNV，危害性和遗传模式)以及2D/3D蛋白质结构(如果有的话)，参考文献及种群信息等。它以ACMG变异致病性变异分类支持作为补充， 并作为一种补充性的评估工具,促进基于分子和临床专业知识整合的多学科团队决策，从而实现可靠的基因诊断。系统性地捕获罕见和极罕见遗传病的患儿个体的分类和定量表型数据，也将有助于促进利用统计学方法来确定每种疾病的识别模式。这将使得在（历史数据中，译者注） 已检测过的个体中所观察到的表型，与 （当下案例中，译者注） 由基因检测所产生的每种疑似致病基因型相关的所预期的表型之间，进行表型相似度的可靠的评估成为可能 （FIG.4b）。数据共享。基因组数据的解读高度依赖于对对照群体和患者群体变异数据库的运用。然而，广泛的数据共享将面临后台维护的挑战 一一因其绝对庞大的数据量，和伦理方面的挑战一一缘于不可能将基因组序列数据真正匿名化（BOX1）0通过DECIPHER和PhenomeCentral 等资源共享组织化的或疑似表型变异的关联将促进这一进程，并最大限度地减少每个人共享的变异数量。诸如GA4GHMatchmakerExchange 之类的举措，将这些数据与其他资源如（GeneMatcher）联合起来，从而增加了搜索范围。ACMG最近发表了立场声明，即实验室和临床基因组的数据共享，对于改善遗传医疗保健至关重要。 WES和WGS技术使我们能够在已知知识范围内进行罕见病的基因诊断，并可以通过仔细阅读当前的文献，掌握适当的注释平台和知识库的工作知识，以及与研究工作进行对接等方式加以不断巩固。理想状态下，这个框架应该由一个协作的基础设施来补充，以支持功能化和模式生物研究，从而带来更广泛的专业知识来实现可靠的分子和临床诊断。临床应用的考量临床评估基因组变异诊断的重要性，并将值得关注的结果传达给家庭和其他卫生专业人员，这些过程应具备的专业知识，是在卫生保健系统中引入NGS检测的必要前提。一个拖延多年悬而未决的诊断难题，常常会在新技术（如NGS）和新知识（如新致病基因的发现）的出现时迎刃而解，它们在当今的出现使得诊断成为可能，而这在数年前是不可能的。适当使用 WES和WGS，有可能为罕见和极罕见的儿科疾病患者大大缩短诊断的 长篇史诗”,还能避免经常需要进行的侵入性和昂贵的检查手段，例如肌肉活检和腰椎穿刺。然而，特别是对于非常年轻的患者，那些可能促进临床诊断的检查应继续与WES或WGS并行，因为这些检测结果可能有助于确定由诊断流程中发现的候选变异所提示的诊断的有效性（或恰恰相反）。在 NGS检测之后可能还需要进行后续的检查（例如酶活性检测或头颅磁共振成像 MRI扫描），用以确认在候选诊断中通常出现的特征是否存在，以及提示的诊断在临床上是否合理。患儿呈现的临床表型特异性越低（例如新生儿张力减退），确定候选变异是否是相关的发现就越难。在新生儿重症监护病房（NICU）仔细选择患儿后，可以在26小时内为危重症婴儿完成基因诊断，但在大多数医疗机构中，由于缺乏有关的专业知识和相应的准备工作，且目前这种快速检测的成本过高，这样的加急诊断仍然无法实现。然而，它表明了快速诊断是可行的，并且为改进现有的以月、而非以天为单位的检测周期提供了强大的驱动力。 （译者注：2018年2月，这一快速诊断的世界纪录被刷新至19.5个小时）临床专业知识。虽然对于少数病症（如软骨发育不全，GeneticTestingRegistryMIM100800） 可以从基因型或可靠的临床判断中作出明确的分子诊断，但对于大多数罕见病，建立可靠的基因诊断需要整合分子遗传或基因组数据（基因型）与患者的临床特征（表型）的相关性 （FIG.3）o在大多数情况下，尚无法准确确定所需要的表型层级，通常建议由具有罕见疾病专业知识的临床医生来进行专家评估，以确保严重遗传疾病患儿的分子诊断是有依据的。同样，分子诊断结果能否完整解释患儿的临床表型，或者是否存在混合表型，也是值得专家评估的。对患有严重疾病的年轻患者提供终身基因诊断服务，这对于患者及其家属实现安全及恰当的持续管理至关重要。根据遗传变异的不同，这一过程通常需要对近期主要的出版物进行回顾，并进行额外的临床评估和调查，以确定临床适用性，并证实或排除之前所提示的分子诊断结果，同时进行家系共分离分析以确定提示的分子诊断结果是否符合所观察的家系中的遗传模式。此外，对于罕见 /极罕见疾病患者，应投入时间去充分调查研究试验性疗法的可行性。这一系列的医疗关怀是非常耗时的，但对基因组医学的安全实践至关重要。在一般的儿科咨询中，履行上述关怀所需的时间和专业知识可能不容易达到，因此转诊到临床遗传学服务单位可能更为合适。在哪个场景需要临床基因组学专业知识的参与，是在提交检测申请时，还是在评估候选变异时，还是两种情况都需要，目前尚不清楚。基因组阵列分析的临床实践经验表明，一旦确定了候选变异就需要临床专家对其进行评估，以确定它们是否是可靠的基因诊断结果，因此在此时专业知识的介入为最佳。对于最初 WES或WGS检测报告为阴性但遗传学仍提示可疑的这类患者，也将从遗传学专家的评估中受益。随着 WGS的应用越来越广泛，临床上对WGS数据的再分析可能成为临床遗传学家关注的重点，因为以表型信息的获取和以患者为核心的分析可以提高诊断率。如果可以确定一个可能的临床诊断，那么可以在不太严格的情况下以及用更多的分析策略对现有的NGS数据进行重新分析，以尝试识别标准诊断分析流程中所忽略了的那些变异。检测对象。患者的选择是至关重要的，要确保WES或WGS的适用对象主要是单基因病的患者 （BOX2）。在这种情况下，将WES或WGS作为常规检查的一部分用于排除疾病的遗传原因则是非常有问题的。许多诊断途径，特别是在儿科神经病学中，使用各种生物化学检查来排除罕见病，例如先天性代谢缺陷，这种方式的每种个体病症导致临床表型的先验概率非常低。这是长期以来建立的部分临床实践，这种做法在正常范围值有充分记录的情况下可能是恰当的。然而，由 NGS产生的大量不确定变异，以及缺乏可靠性使得这些变异被明确指定为良性或致病性，这意味着将 WES或WGS用作遗传病的通用排除性检测是不合适的；因此，目前 NGS的检测应该对临床高度怀疑有潜在遗传病的患者保留检测。事实上，通过适当的病例选择，NGS诊断可以变革诊疗。最近的一项研究为可能是单基因遗传病的NICU患者建立了WES分子诊断方法，结果显示 32例患者中有23例（72%）的诊断改善了临床诊疗。检测方法的选择。 检测的选择受到许多因素的影响，尤其是临床诊断的信心度、表型特异性以及NGS测序、分析和解读的成本和可用性（FIG.2c）。例如，对于脂肪吸收不良的婴儿，最恰当检测方案是 88毫摩尔/升的汗液氯化物测量及临床诊断为囊性纤维化进行 CFTR的单基因检测，而非WES或WGS检测。一般而言，临床特征的基因异质性越高， WES或WGS的适用性就越大。然而，检测的范围（即所涵盖基因的数量）越广泛，解读结果所需的专业知识要求就越高， 特别是对于许多缺乏简单的确证性检测 （例如酶活性测定）的疾病。无论是用于研究还是诊断，WES在专家手中都胜过panel检测，但它在日常临床条件下， 是否能更好地进行精准诊断则是另一个问题，而目前很少有公开的研究来告知和指导临床实践。现在精心设计的WES检测方案包括高效捕获启动子、剪接区以及编码序列，使大多数导致罕见病的SNVs可被检测到。 在2016年，WES的成本不到WGS成本的三分之一（内部数据），所以Trios家系WES检测与先证者WGS检测的成本大致相当。Trios家系分析的额外优势是可以检测新发突变 （发育障碍疾病患儿最常见的原因）这一点和我们目前尚无法解读的非编码区变异结合起来意味着，在成本是一个限制因素的情况下，对于儿科罕见病的诊断，Trios家系WES检测模式优于先证者WGS检测模式。尽管如此，WGS在全外显子组数据质量方面的优势，以及对非编码区变异和染色体结构变异的信息获取等方面，可能最终将超过 WES目前的成本优势。复杂性。一些患者存在两种或更多种的遗传诊断导致其呈现出混合表型，这种情况为诊断带来挑战。据估计，多种遗传诊断集于一个患者的概率约为5%。因此，临床医生需要考虑基因检测确定的候选诊断能否提供对患者临床表型的全面解释，还是仅为部分解释而主要诊断仍待确定 （BOX3）。即使对于单一阳性诊断的患者，在个体患者中观察到的临床特征也很少是单独变异的结果。一个基因中的主效应变异，可以与基因中的中等效应的变异以及大量具有微效应的变异（通常位于基因组非编码区）发生协同作用。这些变异的联合效应，与环境暴露因素一起作用，可能会影响临床特征的外显度和表现度，从而决定最终呈现出的临床表型，这也就解释了具有相同遗传诊断的个体之间所见到的一些表型差异性。这种复杂性可能又是正常人群中许多行为和发育性状的基础。对于一些个体，即使没有单一的主效应变异，累积的中等效应和微效应的不利变异的累积负荷也可能导致疾病的发生，例如自闭症障碍谱系。 随着时间的推移，我们对这种复杂性的理解可能会得到改善，并可能将来自高度外显单基因的数据与遗传风险评分进行整合，从而更好地对患者进行分层，进行个体化的预后评估和管理。Box2|WES，WGS或panel用于儿科基因组分析的适应症神经发育障碍性疾病：例如发育迟缓和 /或认知障碍（需要或可能需要特殊教育的程度）、癫痫性脑病或严重脑瘫。先天性畸形：多发性先天性畸形（两种或两种以上的畸形）或单一主要畸形伴有神经发育障碍、生长缺陷、畸形特征或异常行为。异常生长参数（身高、体重、头围）：两个或两个以上的参数异于（大于或小于）正常人群平均值3个标准差以上，或单个参数异于正常人群平均值 4个标准差以上（肥胖症除外，其中孤立性肥胖的阈值大于4.5个标准差则强烈提示遗传病因）。畸形特征。行为异常或极端行为表型，合并上述一个或多个体征，则强烈提示遗传致病。通过简单的遗传学基础依据判断以下情况可能与遗传病相关：一个家族中数个成员受累；在同一家族中有另一家族成员受累，且其具有罕见的、与先证者一致的和独特的表型；或与特定严重表型相似的单个病例。价值。精准的基因诊断的益处包括更好地判断预后、更有针对性的疾病管理以及疾病监测的改善。精准的基因诊断使得能够向患者及其家属提供准确的遗传咨询，并且可以为他们提供额外的优生选择，例如通过实现胚胎植入前诊断、非侵入性产前检测或产前诊断。它还有助于改善患者的健康、教育、社区医疗服务以及来自患者支援团体的信息分享和帮助。一旦有了可靠的分子和临床诊断，GeneReviews和Orphanet 等资源库为临床医生提供疾病管理方面的专家建议， Unique和GeneticsHomeReferenee等资源库库也将能够为患者及其家属提供简洁、便于患者使用的疾病讯息摘要。在早期进行专家评估时， NGS的运用提供了一种经济有效的方法，既可以提高诊断的机会，又可以显著缩短诊断时间。 在某些情况下，基因诊断还可以带来更好的、或更个性化的治疗。在儿科领域，外显子组和基因组测序的应用，已经在发现新基因、基因诊断、患儿生活品质改善的案例研究报道中有许多惊人的进展。例如，在一项神经代谢性疾病患者的研究中，WES检测使68%的患儿得到确诊，新发现了 11个候选致病基因，并为其中的44%患儿提供建议从而改善了治疗。Box3|案例研究表明需要对候选变异进行专家评审对某婴儿癫痫性脑病的患儿进行基因组微阵列分析，检测到 1q21.1上〜900kb的denovo致病性大片段重复CNV变异。一个没有经验的临床医生可能会认为该拷贝数变异即是对该患儿病情的确切诊断，因为大约有 15-35%携带这种拷贝数变异的儿童会表现岀癫痫发作。然而，1q21.1微重复综合征患儿的癫痫发作通常在儿童期发病，并非婴儿期，且对一线药物治疗反应良好，所以该变异更可能只参与导致了该 患者次要的临床表型，而主要表型的诊断在本次检测中尚未得岀。对患儿及其父母进行 Trios家系模式的全外显子测序分析（ WES）后发现，该临床表型主要是由于 CHD2基因上新发的c.910G>T，p.Glu304Ter截短突变所导致的。由熟悉罕见病诊断的临床医师对基因检测找到的变异进行专家评估是至关重要的，因为这样可以确定找到的变异是否是导致患儿临床表型的全部原因，还是协同因素，抑或是无关的发现。儿科基因组学是一个快速发展的领域， 对疾病分子基础更深入的理解已经开始改善目前我们可提供疾病治疗的质量。未来很可能会形成更优化的工作流程，可以找到更广泛的临床应用，并带来新的治疗选择。儿科基因组工作流程实施的改进。 儿科基因组学尚处于起步阶段，如果以儿童发育水平作类比的话，也许它正处于幼儿阶段。在这个阶段，新技能的探索和获取与频繁的挫折和失败将会交相出现。通过多学科小组会议和专家临床评估等对变异解读的协助，基因组诊断将越来越多地应用于许多儿科细分专业。然而，在有效的基因组医学服务所需分析流程的几乎每一个方面都尚在不断发展时，优化实施方案是非常具有挑战性的。临床医生正在学习在患者临床检查流程中最合适的时机和地方应用基因组检测；测序公司正在开发读长更长的测序技术；生物信息学家正在不断优化对不同变异类型进行识别的算法；人群数据库无论是在深度，还是在代表不同种族的样本上都在不断增加；致病基因的发现，无论是鉴定与疾病有关的新基因，还是越来越多地认识到的基因遗传多效性方面，都在持续快速发展；尽管基因变异数据库和文献报道仍然会有错误致病性判读的严重污染，但它们仍在不断增长并持续改善。这些参数中的每一个都有可能影响到检测性能，特别是灵敏度和特异性。关键目标是要优化变异的检测识别和过滤，以便该过程最大限度地增加真实诊断的可能性，同时最大限度地减少任何检测所带来的误诊或过度诊断；成功的诊断，需要集中关注患者的临床探查、表型、导致疾病的相关变异类型的全面检测、基因 panel的选择以及适当的专业知识。因此，在遗传医学安全和有效的实践中，生物信息学家、临床科学家和临床专家都发挥着重要的作用。集成多元数据以提高诊断能力。 NGS技术为其他全基因组技术如转录组学、表观基因组学、代谢组学和蛋白质组学的应用铺平了道路，这些组学技术可用以研究遗传变异对特定组织的功能影响。虽然这些方法还没有在临床诊断中常规地实施，但它们会越来越多地用于确定基因组变异的致病性。例如，对儿童神经肌肉疾病患儿结合 WGS和肌肉活检样本的转录组学分析，能够对基因外显子区和非编码区的候选剪接位点突变进行验证，并确定可变剪切体，从而使总体诊断率达到 35%。此外，使用转录组学数据指导基因组数据的再分析，可能使原先从 WGS或WES检测结果中未找到明确候选变异的患者的21%得到诊断。在许多情况下，更深层次的表型、或标准图像、或生化和电生理检测，对于确定特定基因组变异的功能性影响是至关重要的。尽管CFTR的序列在1989年就已被确定,且囊性纤维化和CFTR相关疾病在罕见病中还属于最普遍的一些疾病，即使到了 2017年,CFTR基因中鉴定发现的约2,000种变异中的大多数也还都是罕见的或孤立的。目前正努力地大规模地全面评估 CFTR变异的基因型、表型和功能，这些均表明未来任务的艰巨性。基因组学在胎儿、新生儿和成人疾病诊断中的应用。儿科学在遗传医学领域中占据主导地位，而基因组学对它的影响比其他学科更大，原因有很多。例如，对胎儿和新生儿进行疾病的基因组学诊断就会出现挑战，因为与发育后期相比，发育前期的临床表型特征较少，且不特异