家兔心肌缺血再灌注模型的改进

家兔心肌缺血再灌注模型的改进

有效的心肌疾病治疗方法是在有限的时间窗口内对冠状动脉进行重新连接。持续静脉虹膜滴注会给心肌带来严重的二次损伤。于是,再灌注损伤的实验研究显得更为重要。在以往的实验研究中,大多数实验采用大鼠结扎冠脉的方法进行模拟再灌注损伤,评价标准或者不明确或者单一不可靠等,参考以往文献结合本实验小组在过去5年的实验经验,本实验选择家兔作为实验动物,尽可能地钝性剥离组织进行造模,并且以心电图、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、常规病理切片4项作为综合评定指标进行评价,有效建立缺血再灌注损伤模型。1材料和方法1.1动物和小组雄性新西兰兔45只,由黑龙江中医药大学动物室提供。随机分成3组,每组15只,体重(2.5±0.15)kg。1.2日本血酸酯基甲酸乙酯法BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司);日立KY2000半自动生化仪(日本);氨基甲酸乙酯(上海山浦化工有限公司);肌酸激酶试剂盒-CK(速率法)(北京北化康泰临床试剂有限公司);肌酸激酶同工酶试剂盒-CK-MB(速率法)(北京北化康泰临床试剂有限公司)。1.3左动脉前降支、左心肌梗死支的制备家兔常规麻醉、剃毛、消毒后固定于木质手术台上,沿家兔胸前区正中线偏左0.5cm处剪开第4肋到第2肋间的皮肤,沿胸肌肌纤维走行的方向钝性分离左侧胸部肌肉,用1/2弧形圆针穿1号非吸收性外科缝线,从第2肋间进针于第3肋间出针,以手术线代手术刀(剪),沿着第2、3肋钝性割开肋间肌,剪断第3肋软骨,暴露胸腔,待家兔呼吸平稳后,用镊子轻轻提起心尖部心包膜,纵行剪一切口,用镊子手柄部轻轻上抬心脏暴露左心室和心尖血供的左冠状动脉前降支及左旋支。在左冠状动脉前降支起点与心尖连线的中点位置用0号非吸收性外科缝线结扎左冠脉左室支。模型组:结扎时垫一根硅胶管,心电图Ⅱ导联示ST-T明显抬高,表示结扎成功,待结扎45min后剪断手术线实现再灌注,再灌注3h后采血,摘取心脏留取左室组织,假手术组只穿线不结扎。1.4he染色10%福尔马林固定,常规脱水、透明、浸蜡、包埋,切片厚0.5μm,用苏木素、伊红进行病理染色。1.5验数据的表型用SPSS15.0软件进行数据分析。实验数据采用x¯±sx¯±s表示。统计学分析采用ANOVA方差分析、两样本均数的t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1模型组和空白组特性假手术组与空白组比较,CK、CK-MB有轻微增高,但无统计学意义,模型组与空白组比较,CK显著增高,有统计学意义(P<0.05,附表),CK-MB虽有增高,但无统计学意义(P>0.05,附表)。2.2心电图显示再灌注家兔冠脉结扎后,心电图ST-T较正常明显抬高,结扎45min以后,剪断手术缝合线,ST段逐渐回落,再灌注3h后,心电图显示实现再灌注(图1)。2.3大量炎细胞及红细胞浸渍空白组:心肌结构清晰,肌纤维排列规整,细胞完整,无水肿断裂,无炎细胞及红细胞浸润。模型组:肌纤维排列紊乱、扭曲,发生断裂,细胞结构破坏,大量炎细胞及红细胞浸润。假手术组:肌纤维排列规整,间隙稍有改变,局部可见少量细胞浸润(图2)。3心肌缺血再灌注损伤的防治对策随着现代科技的发展和医疗水平的提高,心肌缺血再灌注损伤是心脏移植、心肌梗死再通等的重要伴随病理损害过程,如何减少心肌缺血再灌注损伤的研究具有重要的意义。因此,一个操作规范、评价标准准确的心肌缺血再灌注损伤模型尤为重要。本实验选择家兔作为实验动物,在以往研究的基础上对造模手术进行改进,通过多项评价指标综合进行评价,建立一个操作规范合理、评价标准准确的心肌缺血再灌注损伤模型,为研究心肌缺血再灌注损伤提供模型和奠定基础。3.1开胸、数据缝合本研究的实验动物选择家兔,其主要原因为家兔的生理结构与人相似,有独立的纵膈结构和胸膜腔,小心开胸可避免气胸的发生,缝合后更利于家兔的存活。其次,避免运用呼吸机,因为在以往的实验手术操作过程中发现,呼吸机应用不合理,各项指标很难确定,调节不适,肺脏充气过度,会对心脏造成按压,使得心电失真,不能准确反映心脏的真实状态。3.2心肌细胞受损时表现为+ndf-b本模型的制备过程中,手术方法尽量采用钝性分离,尽可能减少软组织的损伤,并且结合自制棉线拉钩能够很稳定的操纵整个实验过程,减少因心肌以外的软组织损伤造成的酶谱升高对实验的影响。同时,在模型评定的指标中综合运用心电、心肌酶(CK,CK-MB)与病理切片相结合共同作为成功与否的标准,心电作为结扎成功与复灌的直观视觉指征,心肌酶(CK、CK-MB)作为再灌注损伤的客观指标,原因在于CK非心肌所特有,手术所导致的其他软组织损伤也会造成CK升高,而CK-MB为心肌特有,只有当组间CK有明显差异,而组间CK-MB无差异,说明心肌细胞受损但并没有缺血坏死,如果CK、CK-MB都存在差异就说明已经造成心肌梗死,心肌细胞已经坏死,此模型用于再灌注损伤无意义可谈,CK有明显差异可为手术损伤造成。而CK-MB未见变化,说明心肌细胞未破损,实现真正意义上的缺血再灌注。病理切片更能客观地展示缺血再灌注损伤的程度。综上所述,以钝性分离的手术方法造成心肌缺血再灌注损伤模型,心电图明显变化,心肌酶谱组间CK有明显差异,而组间CK-MB无差异,同时,病理切片再次支持再灌注而非心肌坏死,从而,成功完成缺血再灌注损伤的模型的制备。3.3烧结时间与再灌注时间的调整本模型用于急性或慢性实验均可,在进行预实验时,以结扎时间与再灌注时间为变量,依据