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文档简介

神经生物学科研中心

分子生物学平台张宝乐“从RNA提取到荧光定量PCR”的解决方案一、RNA提取及反转录样品收集提取RNA的样品要保证“新鲜”

（屠宰后，立即放入液氮，过夜后转入-80℃冰箱）RNA提取

防止RNA酶的污染：DEPC处理150-180℃烘烤3-4hTrizol-氯仿（氯仿-异戊醇49:1）-异丙醇-75%乙醇试剂盒（离心柱滤膜吸附法）提取方法：RNA检测

甲醛变性电泳:三条带（28、18、5.8/5S）

紫外吸光值检测：

OD260/280(1.8-2.0)

（＜1.7蛋白质或酚污染；＞2.1异硫氰酸残存或降解）

OD260读数（0.1-0.5）(线性关系好)

RNA得率=OD260*稀释倍数*40ng/µl反转录

模版：

总RNA、mRNA、体外转录的RNA引物:oligo（dT）、随机引物、基因特异引物(GSP)反转录酶：

防止RNA二级结构导致的反转录失败：

RNA65℃5min，冰上3-5min，立即42℃反转录加入氢氧化甲基汞（CH3HgOH）或解链蛋白

使用耐受高温（55-65℃）的反转录酶反转录检测

利用内参基因检测反转录效果，如GAPDH,β-actin等。利用普通PCR初筛定量引物

特异性、避免产生引物二聚体

产物长度90-300bp之间

退火温度：60℃左右（内参和目的基因一致）考虑目标剪接体（若基因存在可变剪切）尽量跨内含子设计引物Real-timePCR检测

确定引物的有效性（扩增曲线、熔解曲线、标准曲线）二、Real-timePCR荧光定量PCR原理－－常用名词概念扩增曲线荧光阈值Ct值荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（thresholdvalue）。NOTE:采用72℃延伸时采集荧光!95℃60℃左右NOTE:质粒获得后，用限制性内切酶单酶切，使其线性化！

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