园艺植物生物技术第四章

Plantcellengineering应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的试验方法和技术，在细胞水平上研究改造园艺植物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或园艺植物新品种的科学。MaincontentsPlantcellcultureProtoplastIsolationandFusion1.

Plantcellculture

Haberlandt(Austria): Cultivateisolatedplantcells

invitroonanartificialmedium--->Concept：

指对植物器官或愈伤组织上分离出来的单细胞(或小细胞团)进行培养，形成单细胞无性系或再生植物的技术。Significance：（1）研究细胞生理代谢过程及各种影响因子；（2）用于植物品种的改良；（3）用于植物次生代谢物质的生产。1.1.1Isolationofsinglecella.Isolationofsinglecellfromleafdirectly（1）mechanicalmethod：研磨→过滤，离心→细胞纯化（2）enzymolysismethod：果胶酶、膜稳定剂、渗透压调节剂硫酸葡聚糖钾甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等1.1Singlecellculture

Basicproceduresofenzymolysismethod取叶片，表面消毒撕掉下表皮，切成小块加入酶解液（0.5%果胶酶+0.8%甘露醇+1%硫酸葡聚糖钾）摇床上保温培养b.

Isolationofsinglecellfromcallustissue（1）离体器官（2）愈伤组织（3）继代培养2个月（4）转至液体培养基震荡培养（5）悬浮细胞（6）无菌过滤，离心（7）单细胞 对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，直到长成完整植株的技术。

1.1.2MethodsofsinglecellcultureCulturemethodsPlateculture平板培养Nurseculture看护培养Microculture微室培养Conditionedmediumculture条件培养基培养a.Plateculture:分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。

方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶等)消化分散纯化的细胞，经计数及稀释，接种到加热熔化而刚冷却至35℃左右的固体培养基中充分混匀，倾入培养皿中，石蜡密封，于25℃培养，约20天后细胞即可生长成团。统计生长情况。b.Nurseculture：

从悬浮培养物或脆弱愈伤组织上用针或玻璃毛细管分离单细胞，每个细胞放在一个方形滤纸片的上表面，而滤纸片放在活跃生长的愈伤组织上进行培养的方法。c.Microculture:悬浮单细胞接种于凹玻片或玻璃环与盖玻片组成的微室内的固体培养基中的培养方法。1.1.3Influencingfactorsofsinglecellculturea.

Medium：特殊成分，植物激素，pHb.Celldensity：平板临界密度103个/mLc.Environmentalconditions

：25℃，1%CO21.2.cellsuspensionculture细胞的悬浮培养是指将游离的植物细胞按一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养的方法。适宜于大规模培养，细胞工程产业的技术基础.1.2.1Proceduresofcellsuspensionculture

愈伤组织

1g愈伤/10ml培养基150、250ml三角瓶（30、70ml培养基）120rpm,25℃黑暗培养,换液1次/3d以防粘稠蔗糖梯度离心或过滤法(淘汰过大或生理状态不好的细胞团)继代培养80rpm（悬浮细胞系稳定以后）继代时间为1周时（原悬浮液：新培养基=1：4）悬浮愈伤组织形成及植株再生愈伤组织要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。适于悬浮培养适于再生植株

a.Batchculture分批培养

分批培养是在一个封闭的系统中进行细胞培养，当培养物增加到一定量时，需继代培养，即取出少量培养物转接于新鲜培养液中。

1.2.2Typesofcellsuspensionculture

Thecellsincultureexhibitthefollowingfivephasesofagrowthcyclei.Lagphase,wherecellspreparetodivide.ii.Exponentialphase,wheretherateofcelldivisionishighest.iii.Linearphase,wherecelldivisionslowsbuttherateofcellsexpansionincreases.iv.Decelerationphase,wheretheratesofcelldivisionandelongationdecreases.v.Stationaryphase,wherethenumberandsizeofcellsremainconstant.b.Semi-continuousculture半连续培养

是利用培养罐等装置进行细胞大量培养的一种方式。在半连续培养时，当培养容器内细胞增殖到一定数量后，倒出一半细胞悬浮液于另一培养罐等容器，再分别加入新鲜培养基继续培养。半连续培养能够重复获得大量均一的培养细胞供进一步利用。c.Continuousculture连续培养

是用一定容积的非密闭系统进行细胞培养的方法，在培养过程中不断注入新鲜培养基，而使营养物连续得到补充，细胞生长和增殖连续进行，同时有等体积的培养物排除系统。

Opencontinuousculture开放型Closedcontinuousculture封闭型1.2.3Requirementsforgoodsuspensionculturesystema.悬浮培养物分散性好，细胞团较小，一般由几十个以下的细胞组成。b.均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。c.生长迅速，悬浮细胞的量一般2-3天甚至更短时间便可增加一倍。1.3ApplicationofcellcultureProductionofsecondarymetabolites

辣椒素、花青素Selectionofmutant突变体的选择Polyploidinducement诱导多倍体生产人工种子2.ProtoplastIsolationandFusion

原生质体的游离与融合2.1.ProtoplastIsolation

Methodsmechanicalmethodsenzymaticmethods2.1.1MechanicalmethodApplicationrangelargeandhighlyvacuolatedcellsofstoragetissuesonionbulbscales,radishrootandbeetroottissueDisadvantages(i)Itisrestrictedtocertaintissueswhichhavelargevacuolatedcells.(ii)Yieldofprotoplastsisgenerallyverylow.Protoplastsfromlessvacuolatedandhighlymeristematiccellsdonotshowgoodyield.(iii)Themethodistediousandlaborious.(iv)Viabilityofprotoplastsislowbecauseofthepresenceofsubstancesreleasedbydamagedcells.2.1.2EnzymaticmethodCocking在1960年证实了用酶从高等植物中分离出原生质体的可能性。Cockingin1960demonstratedthepossibilityofenzymaticisolationofprotoplastsfromhigherplants.Influencingfactors(1)PhysiologicalstateoftissueandcellmaterialProtoplastshavebeenisolatedfromavarietyoftissuesandorgansincludingleaves,petioles,shootapices,roots,fruits,coleoptiles,hypocotyls,stem,embryos,microspores,callusandcellsuspensionculturesofalargenumberofplantspecies.

分离材料包括叶片、叶柄、芽尖、根、果实、胚芽鞘、胚轴、茎、胚芽、花粉粒、愈伤组织和细胞悬浮培养物等。植物幼苗或新生枝的完全伸展叶片的叶肉组织是分离原生质体的最方便、最合适的植物材料。(2)

EnzymesThereleaseofprotoplastsisverymuchdependentonthenatureandcompositionofenzymesusedtodigestthecellwall.原生质体的释放在很大程度上取决于用于消化细胞壁的酶的性质和组成。Threeprimarycomponentsofthecellwall:cellulose,hemicelluloseandpectinsubstances.细胞壁主要成分:纤维素、半纤维素和果胶类物质。Celluloseandhemicelluloses:thecomponentsofprimaryandsecondarystructureofcellwallPectin:acomponentofmiddlelamellathatjoinsthecells.纤维素和半纤维素是细胞壁初生结构和次生结构的成分，而果胶类物质是连接细胞的胞间层的成分。Pectinase:mainlydegradesthemiddlelamellaCellulaseandhemicellulase:digestthecellulosicandhemicellulosiccomponentsofthecellwall,respectively.果胶酶主要是降解中层，而纤维素酶和半纤维素酶分别用于消化细胞壁的纤维素和半纤维素成分。

TheactivityoftheenzymeispHdependentandisgenerallyindicatedbythemanufacturer.pH:4.7-6.0.Temperature:25-30℃Treatmenttime:30min-20h(3)Osmoticum渗透剂Protoplastsreleaseddirectlyintostandardcellculturemediumwillburst.Hence,inis