临床免疫学实验：8人外周血LC细胞分离、计数、活力测定

人外周血淋巴细胞分离、计数、活力测定利用淋巴细胞分离液离心人外周血，根据单个核细胞不同的体积、形态和比重，将离心后呈密度梯度分布的单个核细胞分离出来。密度梯度离心法人外周血RBC、粒细胞比重为：1.092单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，比重为1.075因此选用一种比重介于二者之间而近于等渗的淋巴细胞分离液（比重为1.077±0.001）进行密度梯度离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布，从而分离出单个核细胞（淋巴细胞）

【实验原理】淋巴细胞分离液组成：聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-hypaque）1．肝素溶液用生理盐水将肝素配成125～250U/ml的溶液，置4℃下保存备用。2．淋巴细胞分层液市售或自配，20℃时密度应为(1.077±0.001)g/L。3．Hanks液

pH7.2～7.4。4．完全RPMI-1640培养液。5．15ml或50ml锥底离心管。6．水平离心机，显微镜。7．玻璃吸管，滴管，细胞计数板等。8．2％台盼蓝染液。【实验材料】

1．采集静脉血3ml，注入盛有肝素的无菌小瓶中（每ml全血加0.1ml肝素溶液），立即轻轻摇匀，使血液抗凝。

2．用吸管加入等量Hanks液，使血液等倍稀释。

3．吸取淋巴细胞分离液2ml置于离心管中，然后将上述稀释血液在距分离液界面上1cm处沿试管壁缓慢叠加至分离液表面。应注意保持两界面清晰，勿使血液混入分层液内。【实验方法】

4．将离心管置水平式离心机内，在18～20℃下，以2000r/min离心20min，离心后，管内分层如下图所示

5．用毛细吸管轻轻插入灰白细胞层，沿管壁轻轻吸出该层单个核细胞，转入另一支离心管中。

6．将所得到的单个核细胞悬液用5倍体积的HanK’s洗涤2次，每次以1500r/min离心10min，弃上清。

7．混悬细胞，沉淀加1640培养液1ml，摇匀。

8．计数细胞：取0.1ml细胞悬液，加WBC稀释液0.9ml，混匀，静止片刻，冲池，低倍镜下计数四大格细胞总数。实际细胞数/ml=Ⅹ×10×1000×10

4

9．台盼蓝染液检测细胞活力:取2滴细胞悬液于玻片，加2％台盼蓝染液1滴，混匀，铺开，高倍镜镜检。3min内计数完100个细胞，计算存活细胞百分率：台盼蓝染液检查活细胞不着色（无色），死细胞染成蓝色。

肝素抗凝静脉血3ml，轻摇匀↓

Hanks液稀释静脉血（加满管），轻吹混匀↓

3ml淋巴细胞分层液中，叠加稀释血液↓

水平离心，2000rpm/20min↓

吸取单个核细胞层（灰白层），移入新试管↓

Hanks液洗涤2次，1500rpm/10min↓

弃上清，加入16401ml混悬，摇匀↓

①计数，WBC稀释液10倍稀释0.1ml，1滴镜下计数↓

②活力测定，2滴加1滴台盼兰混匀，3min内镜检

【步骤】⒈淋巴细胞计数：正常≥1×106/ml，青年人≥2×106/ml.⒉淋巴细胞活力测定：台盼蓝染液检查活细胞不着色（无色），

死细胞染成蓝色。计数100个细胞，计算活细胞百分率，一般活性≥95％。【实验结果】

1．与血液样品接触时应注意安全防护，避免血源性传染病传染。

2．操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细胞活性及细胞丢失。

3．细胞分层液在室温下应为(l.077±0.001)g/L；应避光4℃下保存，取出后逐渐升至室温后混