内生枯草芽孢杆菌b-01对烟草的促生机制及青枯病防治效果

内生枯草芽孢杆菌b-01对烟草的促生机制及青枯病防治效果

合成化学农药和化肥的大量使用不仅提高了作物产量，而且对人类健康和生态环境产生了负面影响。应用微生物代替(或部分代替)化肥和农药,越来越受到各国政府和研究者的高度重视。植物内生细菌与寄主植物在长期共同进化过程中形成了密切的相互关系,且生存微环境稳定,成为化肥、农药和其它微生态制剂的最佳竞争者,其合理应用将减少化学农药造成的环境污染、提高农田生态系统的生物多样性和有利于保持生态平衡。目前利用内生细菌防治植物病害的报道较多,但兼具抗病和促生作用的内生细菌却鲜见报道。作者从烟草中分离出内生枯草芽孢杆菌BacillussubtilisB-001菌株(GenBank登录号为DQ444283),2003年在湖南桂阳县、2004年在湖南宁乡县的小区防治试验中均对烟草青枯病具有良好的防治效果。作者测定了该菌株对烟草幼苗的促生作用及其内源激素含量的变化,并研究其在烟草植株全生育期的生长动态以及不同浓度菌悬浮液对烟草青枯病的生防效果,旨为该菌株的开发和利用提供理论依据。1材料和方法1.1试剂与仪器供试菌株与烟草品种:枯草芽孢杆菌B-001菌株和烟草青枯病菌Ralstoniasolanacarum,由本研究小组分离;烟草种子NC82、云烟87、红花大金元、翠碧1号、K326、K346,由湖南农业大学烟草研究中心提供。试剂与仪器:乙腈、三乙胺购自美国天地公司;磷酸甲醇等,上海国药公司产品;赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、玉米素核苷(ZR4)等激素标样,购自Fluka公司;测定仪器为Agilent1100高效液相色谱仪、G1314A紫外检测器;Spherisorb(R)ODS25μm分析柱(4.6mm×250mm)、聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)柱、二乙基氨基乙基交联葡聚糖凝胶(DEAEsephadexA-25)柱、C18Sep-Pak小柱,Waters公司产品。1.2方法1.2.1菌悬浮液的制备将B-001拮抗菌制备牛肉膏蛋白胨液体培养基种子液后,以5%接种量接种到BPY培养基中(蛋白胨1%、牛肉浸膏0.5%、酵母粉0.5%、葡萄糖0.5%、NaC10.5%,pH为7.0),BPY装液量为200mL/500mL,30℃、200r/min下振荡培养96h,制备浓度为1×108cfu/mL的菌悬浮液备用。1.2.2种子长和株高测定分别将NC82、云烟87、红花大金元、翠碧1号、K326、K346烟草种子浸入B-001菌株的菌悬浮液24h后,分别播种在装有灭菌菜地土的花盆(直径20cm)中,每盆20粒种子,每处理5盆,28℃光照培养,播种后60天,每盆随机取10株苗,测定根长、株高、最大叶的长和宽、鲜重。对照为灭菌水处理。1.2.3高效液相色谱法检测ga3、玉米素核苷的表达将K326烟草种子按1.2.2方法培育,于出苗后15、30、45、60天取整株烟苗,每份15g。将新鲜样品用棉纱布包好立即放入液氮中处理1~2min,避光条件下真空冷冻干燥,充分干燥后密封放入-70℃超低温冰箱中保存。准确称取冻干样品0.5g,分4次加入预冷的80%甲醇11mL(5+2+2+2),弱光下冰浴中研磨匀浆,于4℃冰箱中浸提过夜(15h)。4℃3000r/min离心20min,倒出上清液,残渣加入2mL预冷的80%甲醇后旋涡振荡5min,再3000r/min离心20min,倒出上清液。重复一次上述操作后将残渣丢弃,合并的上清液进行真空冷冻离心浓缩除去甲醇,加入8mL醋酸铵(0.1mol/L,pH9.0)复溶,10000r/min离心20min,上清液经过聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)柱和二乙基氨基乙基交联葡聚糖凝胶(DEAEsephadexA-25)柱,以C18Sep-Pak小柱分别收集细胞分裂素类激素和酸性激素,以50%甲醇将C18Sep-Pak小柱中的激素洗脱至样品瓶,真空冷冻离心浓缩至干,用100μL20%的乙腈溶解进行液相色谱分析。吲哚乙酸、赤霉素的色谱测定条件为起始2%乙腈、100%磷酸溶液,60min后17%乙腈、83%磷酸溶液,73min后30%乙腈、70%磷酸溶液,流速为1mL/min;检测波长:GA3为198nm、IAA为212nm,根据外标法定量。脱落酸、玉米素核苷的色谱测定条件的起始浓度为零乙腈、100%三乙胺溶液,30min后15%乙腈、85%三乙胺溶液,流速为1mL/min;检测波长:ABA为262nm、ZR4为270nm,根据外标法定量。1.2.4种子水浸剂为b-400诱变菌株的制备参照周燕等方法进行B-001菌株的诱变与接种菌的回收。K326烟草种子用B-001诱变菌株的菌体悬浮液浸种24h,按1.2.2方法培育,以灭菌水浸种为对照。分别于播种后90、120、150、180、210天取烟草根、茎、叶部组织各1g,进行B-001菌株回收。1.2.5烟草青枯病菌感染试验在温室内用淋根法接种无菌烟草苗,处理组每株烟草淋30mLB-001菌液,浓度分别为1×107、1×108、1×109、1×1010cfu/mL,淋根15天后,淋烟草青枯病菌,以烟草青枯病菌淋根为对照。每处理30株烟草。处理后第20天调查发病情况。分级标准参照文献进行。2结果与分析2.1菌液处理对烟草幼苗生长的影响B-001菌株的浸种结果表明,B-001菌株对不同品种烟草幼苗均有明显的促生作用,与对照相比,菌液处理组烟草幼苗根长、株高、叶长、叶宽和鲜重分别增长17.64%~25.53%、27.27%~36.00%、42.16%~48.71%、26.53%~42.85%和43.01%~57.70%(表1)。2.2出芽后30daba含量的变化B-001菌液处理后1~60天,烟草K326中IAA、ZR4、GA3的含量增加;但ABA的含量却始终低于对照,出芽后30天表现最为明显,较对照低60.60%(图1)。B-001菌株处理烟草后引起烟草植株体内促进生长的内源激素含量增加,抑制生长的内源激素含量下降,促进了烟草植株的生长。2.3各部位菌量及叶部菌量B-001菌液接种K326后90~150天内,植株根部的菌量增加至6.27×105~341×105cfu/gFW,茎部的菌量增速较快,菌量达3.84×105~2480×105cfu/gFW,叶部的菌量增速较慢,菌量为0.156×105~12.5×105cfu/gFW;接种150天后,根、茎、叶内的B-001菌株菌量均表现明显的下降趋势(表2),表明在烟草生长前期该菌在烟草植株内的生存能力较强。2.4不同浓度b-400液对烟草青枯病的防效试验结果显示,1×107、1×108、1×109、1×1010cfu/mL的菌悬浮液对烟草青枯病的防治效果分别为50.3%、62.8%、70.2%、70.3%(表3)。表明不同浓度B-001内生菌液对烟草青枯病均有一定防效,随着菌液浓度的增加防治效果有所提高,但当菌量达1×109cfu/mL以上时,防治效果无显著差异。因此,B-001菌株浓度为1×109cfu/mL时,对于烟草青枯病已达到了较好的防治效果。3芽孢杆菌b-400在烟草植株中的生长特性蔡学清等研究认为,内生菌的促生作用主要通过产生吲哚乙酸以及赤霉素等植物激素来促进植物生长。本研究结果表明,经内生细菌B-001菌株处理后,寄主植物烟草体内与生长有关的激素如IAA、GA3等含量增加,但抑制植物生长的激素如ABA含量下降,这与上述报道基本一致。植物内生细菌的密度与植物的基因型、植物组织、生长阶段和环境条件有关。芽孢杆菌B-001菌株在烟草植株中的数量,随植株的不同器官及不同生长期而异。接种90天后,植株根部的菌量为6.27×105cfu/gFW,而植株茎部的菌量为3.84×105cfu/gFW,其原因可能是该菌从植株根部入侵,且根部的生境更利于其生存。芽孢杆菌B-001菌株在烟草植株中的群体数量也随植株的生育期不同而异,从苗期至旺长期,该菌株在植株内的数量逐步提高,旺长期达到最高点;成熟期菌量下降。烟草植株体内芽孢杆菌B-001的群体数量变化的原因可能是烟草植株在开花期生理活动最旺盛、合成的营养物质最多、B-001菌株在植株体内可以获得充分的营养,此时的菌量最多;而烟草植株成熟期,体内的营养向果实输送,植株体内的B-001菌株得不到充足的营养物质而菌量减少。另外在烟草生长后期气温高,菌体繁殖力下降、休眠菌体上升、数量减少,可能与B-001菌株本身的生物学特性有关。Chen等研究表明,