柴胡疏肝散对抑郁模型大鼠行为学及bdnf及其受体rkb表达的影响

柴胡疏肝散对抑郁模型大鼠行为学及bdnf及其受体rkb表达的影响

抑郁是心境障碍，病因复杂。近年来,随着生活节奏的加快,人们生活压力明显增大,普通人群中抑郁症年发病率约为200/10万,且发病率呈逐年上升趋势。调查表明,抑郁症居我国当前精神疾病类首位。抑郁症属于中医学“郁病”范畴,中医证候临床流行病学调查显示,肝郁气滞证为抑郁症最常见的证候类型,居各证之首。本实验研究柴胡疏肝散及其拆方对抑郁症模型大鼠行为学及海马、杏仁核、额叶皮质脑源性神经营养因子(brainderivedneurophicfactor,BDNF)及其受体酪氨酸激酶受体B(tyrosinekinasereceptorB,TrkB)的影响,并探讨其抗抑郁机制。材料和方法1实验动物部:scx湘成年SD大鼠60只,2～3月龄,雄性,体重180～200g,由中南大学湘雅医学院实验动物部提供,动物许可证号:SCXX(湘)4343232。按随机数字表法将实验动物分为:正常对照组(正常组)、模型对照组(模型组)、柴胡疏肝散干预组(中药组)、拆方干预Ⅰ组(拆方Ⅰ组)、拆方干预Ⅱ组(拆方Ⅱ组)及氟西汀对照组(西药组),每组10只。2药材、药品与胶囊柴胡疏肝散处方:柴胡9g陈皮9g川芎9g香附9g枳壳9g白芍15g甘草5g;拆方Ⅰ组处方(疏肝理气):柴胡9g陈皮9g香附9g枳壳9g;拆方Ⅱ组处方(活血柔肝):川芎9g白芍15g甘草5g。药材均由湘雅医院药剂科统一购买,饮片经本院生药学专业副教授雷鹏鉴定,符合中华人民共和国药典(Ⅰ部)要求,全方及拆方分别按照比例称重、混合,首次煎煮:生药与水按1∶8(g/mL)比例,煎煮之前浸泡30min,煮沸后继续煎煮30min,然后8层纱布过滤;再次以1∶6(g/mL)比例重复煎煮1次。将两次煎出滤液合并,60℃旋转蒸发浓缩,冻干,每克含生药8g,冻干粉密封保存于4℃冰箱内备用,使用时100℃水溶解,使用时配置为1.0g/mL的药液;盐酸氟西汀胶囊由礼来公司提供,20mg/粒,批号:J20080016。用蒸馏水配成浓度为0.18mg/mL的药液。3试剂与仪器免疫组化Ⅰ抗BDNF-博士德(BAO565)、TrkB-SANTACRVZbiotechnology(BO110)、Ⅱ抗生物素化羊抗兔IgG-BOSTER(I1107)、Ⅲ抗SABC试剂-VECTOR(PK4002),DAB显色剂-博士德(AR1025),Trizol(Invirogen公司,51174401),SYBRGreenⅠ荧光剂-TAKARA(BK9104),PCR逆转录试剂盒-PromegaA3500(292872),英国TECHNETC-512PCR仪(133540-1),Thermo冰冻切片机(CH1043B0801),瑞士RocheMolecularBiochemicalsLightCyclerSoftwareVersion3.5荧光定量PCR仪(1403694),MoticB5显微镜,麦克奥迪(厦门)销售有限公司(17-TY6937)。4适应环境饲养参考KatzRJ等的方法。在自由饮食、光/暗周期为12h/12h(光照时间为6:00—18:00)、背景噪音为(40±10)db、温度(20±3)℃条件下饲养1周以适应环境。正常组每笼饲养5只,其余各组每笼饲养1只,共接受28天随机应激,包括电击足底(电流强度10mA每隔1min刺激1次,每次持续10s,共30次)、冰水游泳(4℃,5min)、热应激(45℃,5min)、摇晃(1次/s,15min)、夹尾1min、禁水24h、禁食48h和昼夜颠倒,每日随机给予1种刺激,使大鼠不能预料刺激的发生,以避免适应性。5分组患者临床等效量计算c正常组及模型组均灌服等体积蒸馏水,每天1次,连续14天;中药组予柴胡疏肝散全方药液[5.9g/(kg·d)]灌胃,按体重折算相当临床等效量;拆方Ⅰ组予柴胡疏肝散拆方I号药液[3.3g/(kg·d)]灌胃;拆方Ⅱ组予柴胡疏肝散拆方Ⅱ号药液[2.6g/(kg·d)]灌胃;西药组予盐酸氟西汀药液[1.8mg/(kg·d)]灌胃,为70kg成人常规临床用药的等效量。各组灌药时间均为慢性应激第15天开始至造模结束当天。6行为指标的检测6.1体重测于实验第0、7、14、21、28天称重。6.2大鼠单次运动特征scearing于实验第0、7、14、21、28天(上午7:00-9:00在安静房间内)采用Open-field法作行为学评分。实验所用敞箱为木质装置,底面大小为100cm×100cm,划分成100(10cm×10cm)个方格,内侧面均涂黑。将大鼠放在中心方格内,固定摄像头在敞箱上方(排除人为干扰大鼠活动),记录大鼠3min内中央格停留时间(timeofstayingincentralsquare),穿越格数(scoresofcrossing,四爪均进入方格才计数,记为水平运动得分)、双前肢离地(scoresofrears,记为垂直运动得分)、清洁运动计数(timeofgrooming,理毛次数)。彻底清理敞箱后再进行下一只大鼠的试验。6.3大鼠蔗糖溶液的消耗于敞箱试验后进行,各组大鼠给予1%蔗糖溶液150mL、纯水150mL,观察各组大鼠24h内饮用的蔗糖溶液量(蔗糖消耗量)及水消耗总量。7脑样的采集和处理7.1脑组织切片制备每组5只大鼠,共30只大鼠水合氯醛腹腔深度麻醉后,暴露心脏,从左心室穿刺至主动脉根部,固定,剪开右心耳,快速先后灌入4℃生理盐水250mL和4%多聚甲醛200mL,分离除去后颈部肌肉,弯钳剔除颅骨,取脑,后固定,蔗糖内梯度脱水。恒温冷冻切片机连续冠状切片,片厚25μm,出现相应脑区时按12片取1片的原则依次收集脑组织切片。7.2BDNF、TrkB免疫组化采用ABC三步法,严格按试剂盒操作说明操作。7.3采用MoticB5显微镜、电脑和图像分析软件进行图像采集和处理。8实时荧光定量pcr每组5只大鼠,共30只大鼠深度麻醉后,断头取出脑组织,冰上迅速剥离出海马、额叶皮质、杏仁核组织,将其转移至冻存管中,液氮中保存。8.1trizel一步法提取总rna根据NCBIGenebank中BDNF及TrkB基因序列进行引物设计(委托上海生物工程公司)。BDNF:上游引物:5-GGGGTTAGGAGAAGTCAAGC-3,下游引物:5-TGGACAGCCACTTTGTTTCA-3;TrkB上游引物:5-CGTAGGGACACGCACTCTGA-3,下游引物:5-CCCAAGACCAGCAAGCATAA-3;β-actin:上游引物5-CGTTGACATCCGTAAAGAC-3,下游引物5-TGGAAGGTGGACAGTGAG-3。Trizol一步法提取总RNA(TrizolInvirogen公司)。-70℃保存(RNA检验A280/A260≥1.8为合格)。8.2反向转移试验具体步骤严格按照PCR操作规程以及Promega试剂盒说明合成cDNA。8.3荧光定量pcrctin反应反应体系实验管:SYBR荧光染料10μL、cDNA2μL、BDNF/TrkB引物上下游各1μL、DEPC水6μL;内参管:SYBR荧光染料10μL、Cdna2μL、β-actin上下游各1μL、DEPC水6μL。反应条件:预变性,94℃30s,1个循环;PCR反应,94℃5s、60℃5s、72℃45s,40个循环;60℃5s、95℃30s、40℃20s,1个循环。温度反应结束,由熔解曲线判定PCR反应的特异性,根据标准曲线以及荧光曲线的CT值计算定量结果(结果用x¯±sx¯±s表示)。通过2-ΔΔCT计算各部位BDNF、TrkB表达,ΔCT=CT目的基因-CT内参基因,ΔΔCT=ΔCT实验组-ΔCT模型对照组,BDNF、TrkBcDNA表达差别倍数以2-ΔΔCT表示。9统计学处理方法采用SPSS15.0软件统计包,计量资料据用x¯±sx¯±s表示,采用方差分析完成各组均值间的配对比较,P<0.05为差异有统计学意义。组大鼠血清中banf、trkbmrna及免疫组化行为比较1各组大鼠各时间点行为学及体重比较(表1)造模前各组大鼠体重及行为学各指标比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。与正常组大鼠比较,模型组各时间点水平运动得分、垂直运动得分及理毛次数减少,中央格停留时间延长;模型组造模第14天、干预第7、14天蔗糖消耗量减少,体重减轻;模型组干预第7、14天水消耗总量减少,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,中、西药组干预第7、14天各指标均有改善,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01),中西药组各指标比较差异无统计学意义。与中药组比较,拆方Ⅰ组干预第7、14天水平运动得分及体重降低,拆方Ⅱ组干预第7、14天水平运动得分、水消耗总量及体重降低,干预第14天垂直运动得分降低,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与拆方Ⅰ组比较,拆方Ⅱ组干预第7、14天水平运动得分、水消耗总量、体重降低,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与拆方Ⅱ组比较,西药组干预第7、14天水平运动得分、蔗糖消耗量及体重增加,干预第14天垂直运动得分、理毛次数及水消耗总量增加,中央格停留时间减少,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。2各组大鼠BDNF、TrkBmRNA及免疫组化灰度值比较(表2,图1)扩增曲线为S型,目的基因和内参基因扩增曲线整体平行性较好,拐点清晰,基线平且无明显上扬。模型组及实验各组的目的基因和内参基因的CT值均非常均一,中药组海马、额叶皮质、杏仁核区BDNF及TrkB的mRNA表达是模型组的45.60±39.47、32.00±18.90、40.93±31.06、42.31±45.93、43.76±35.50、37.21±41.28倍。光镜下可见BDNF及TrkB阳性细胞主要集中在海马CA3区、杏仁核区、额叶皮质区。与正常组比较,模型组海马CA3区、额叶皮质、杏仁核区BDNF及TrkB灰度值增加,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,中药组、西药组各部位各指标降低,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,拆方Ⅰ组除额叶TrkB无变化外,其余指标均下降,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。疏肝理气养血药、通肝利肝抑郁症属中医学情志疾病,相当于“郁病”、“脏躁”等病证的范畴,是由气机郁滞、脏腑功能失调而致心情抑郁,情绪不宁,胸部满闷,胁肋胀痛等为主要临床表现的一类病症。郁病的病因有内外两个方面,《医经溯洄集·五郁论》曰:“凡病之起,多由乎郁,郁者,滞而不通之义。或因所乘而为郁,或不因所乘而木气自郁,皆郁也”。《证治汇补·郁证》说:“郁病虽多,皆因气不周流,法当顺气为先…”。柴胡疏肝散始见明·《医学统旨》,明末张介宾收入《景岳全书·古方八阵》卷五十六。原方用于“治胸胁疼痛,寒热往来”,由“醋炒陈皮、柴胡各二钱,川芎、麸炒枳壳、芍药各一钱半,炙甘草五分,香附一钱半”组成,具有疏肝理气、活血止痛之功效,主治肝气郁结所致胁肋疼痛,寒热往来,痛经等。方中柴胡、枳壳、香附、陈皮疏肝解郁,理气畅中;川芎、白芍、甘草活血定痛,柔肝缓急。肝气郁结日久,由气分累及血分,血行不畅而致血瘀。方中配伍活血化瘀之品,能加强理气药行气解郁之功效。慢性应激可以引起人类及动物的下丘脑-肾上腺皮质轴功能亢进,且出现抑郁状态。本实验采用慢性轻度不可预见性应激与孤养相结合的方法复制抑郁大鼠模型,采用行为学检测法,结果标明各肝郁模型组大鼠体重增加减慢,糖水消耗减少,水平及垂直得分减少,中央格停留时间增加,理毛次数减少,说明抑郁模型复制成功。经柴胡疏肝散及氟西汀治疗后,上述症状明显改善。BDNF是1982年由德国生物学家Barde及其同事首次从猪脑中纯化并发现具有防止神经元死亡功能的一种蛋白质,是神经营养因子家族的主要成员之一。TrkB为BDNF的功能性受体,当BDNF与TrkB结合后启动细胞内信号转导途径,从而产生相应分子对神经元的保护及促进再生作用。BDNF只有通过与TrkB的特异结合,才能启动一系列底物磷酸化,从而发挥其生物学效应。BDNF及其受体TrkB广泛分布于中枢神经系统,尤以大脑皮质及海马区域含量最高,在周围系统,如心、肺、骨骼肌也有低水平表达,对神经元的生存、生长、分化具有重要影响。目前普遍认为