内皮细胞分离培养鉴定方法及其生物学特性

内皮细胞分离培养鉴定方法及其生物学特性

内陆祖细胞（epcs）在肉芽组织形成、肿瘤血管生长、四肢和心肌缺血过程中形成新血管，促进血液循环和伤口的恢复。目前,体外分离培养EPCs方法众多,主要有差速贴壁筛选法、梯密度离心法、流式细胞仪分选法及免疫磁珠分选法等。梯密度离心法和差速贴壁筛选法操作简便,费用低,对仪器要求不高,但细胞纯度相对较低。免疫磁珠法及流式细胞仪分选法能获得纯度较高的EPCs,但操作较为复杂,费用也较高,对细胞有一定的损伤,分选获得的细胞数量少,只能针对单一细胞表型,不能分选多种细胞表型的细胞群,绝对纯化某一抗原阳性的EPCs必然会丢失另一部分来源的EPCs。此外,EPCs的诱导分化还需要特定的微环境,可能还需要许多生长因子,包括细胞之间通过接触传递某种信号或分泌的某些因子。因此,本实验拟结合梯密度离心法与差速贴壁法分离大鼠骨髓单核细胞,然后使用内皮细胞专用培养基EGM-2-MV-SingleQuots进行体外培养、纯化、扩增并鉴定,以期为构建组织工程血管、创伤修复、血管新生提供EPCs种子细胞来源。1材料和方法1.1细胞培养和sq1pe-小鼠、vegfr-2、sch3的抗凝剂、sq-射线pe-小鼠、c-ifSD大鼠40只,雄性,3~4周龄,体质量(84.00±6.13)g,由中科院上海实验动物中心提供。EGM-2-MV-SingleQuots培养基,PE-小鼠抗CD34单克隆抗体,FITC-小鼠抗血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)单克隆抗体,FITC-小鼠抗CD133单克隆抗体,SW-CJ-IF净化工作台,恒温CO2培养箱,Olympus倒置相差显微镜,TCSSP2激光共振焦显微镜。1.2细胞培养和增殖采用颈椎脱臼法处死大鼠,置于75%乙醇浸泡消毒5~8min,无菌PBS溶液冲洗。在超净台上将大鼠固定于无菌解剖台上,取下大鼠完整的股骨和肱骨,浸泡在含有PBS的培养皿中。剪开两端骨骺皮质层,显露骨髓腔,用1mL注射器吸取PBS反复冲洗骨髓腔直至骨质呈白色,吹打均匀制成细胞悬液,吸管吸取,沿试管壁缓慢滴加于含等比例的淋巴细胞分离液液面上,2000r/min,离心30min。吸管吸出悬浮在上、中层界面处的中间云雾层(单核细胞层),置于另一个50mL离心管中,加5倍体积的PBS,混匀,1000r/min,离心10min。重复洗涤2次,弃上清,加入EGM-2-MV重悬细胞。混匀后计数,以1×106/mL密度接种于细胞培养瓶中,培养于5%CO2、37℃培养箱中。48h后将上清液中未贴壁细胞移入另一培养瓶中继续培养。分别观察48h内和48h后贴壁细胞的细胞形态和增殖能力。待细胞融合约80%时传代。传代后计数上述两组的平均细胞数。1.3细胞形态观察从首次接种后24h开始,每日于倒置显微镜下观察细胞形态并采集图像。1.4内陆祖细胞的鉴定1.4.1细胞激活和凝集素1ficilact取第2代EPCs,胰酶消化后收集,调整单细胞悬液密度为105~106/mL,重悬于孔底部放有盖玻片的6孔板中进行细胞爬片,培养3d;弃上清,PBS洗涤3次,每孔加入1mL培养基和2.5μLDil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL),置于37℃,5%CO2培养箱中孵育1h;2%低聚甲醛固定细胞20min,每孔再加入1mL培养基和10μLFITC-UEA-1(FITC标记的凝集素-1),置于37℃,5%CO2培养箱中孵育1h;取出细胞爬片,防粹灭剂中性树脂封片,激光共聚焦显微镜下观察,采集图像。显示红色荧光为吞噬了Dil-ac-LDL的EPCs,显示绿色荧光为结合FITC-UEA-1的EPCs,双染阳性为橙色荧光,为正在分化的EPCs。1.4.2荧光标记检测pe-cd33取第2代EPCs,用胰酶消化制成单细胞悬液,计数并调整细胞密度为105~106/mL,分装成3个EP管,第1管加入10μLPE-小鼠抗CD34单克隆抗体和10mLFITC-小鼠抗CD133单克隆抗体,第2管加入10μLPE-小鼠抗CD34单克隆抗体和10μLFITC-小鼠抗VEGFR-2单克隆抗体,第3管加入PE-小鼠IgG二抗作为同型对照。3管同时置于4℃避光孵育60min,PBS清洗2次,各管分别加入2%低聚甲醛500μL,固定45min,流式细胞仪检测。以488nm氢离子绿光为激发波长检测PE-CD34,以633nm氢离子红光为激发波长检测FITC-VEGFR2及FITC-CD133,每次计数5000个细胞,流式细胞仪分析荧光标记阳性细胞的比例。阳性率=各抗体相应象限数值-对照组相应象限数值,每组设3个样本,结果取平均值。1.4.3细胞收集分离取第2代EPCs,胰酶消化后收集制成单细胞悬液,1000r/min,离心5~7min,弃上清收集细胞;2.5%的戊二醛4℃固定过夜,用0.1mol/LPBS(pH=7.0)漂洗样品2次,每次30min,1%锇酸溶液4℃固定样品30min,丙酮梯度脱水、浸透、包埋、超薄切片、铅染色等步骤处理后,透射电镜下观察并采集图像。2结果2.1第1代细胞增殖首次接种后24h内,单核细胞呈小圆形,悬浮在培养液中。48h内贴壁细胞胞质少,呈长梭形,细胞胞体较大,部分胞体融合,含有大量成纤维样细胞,呈漩涡样排列;经传代培养2次后,细胞形态以梭形为主,单层细胞融合成纤维样结构。48h后贴壁细胞以短梭形为主,也有三角形、多角形及纺锤形,培养7d后有明显干细胞集落出现,细胞胞质多,胞核小,集落中间的细胞为圆形,周边为梭形,呈出芽生长,这种结构类似于血岛,呈放射状排列。平均每代生长周期为3~5d,细胞增殖至第6代未见明显衰老。第6代以后,细胞开始逐渐接近于内皮细胞,呈典型的铺路卵石样外观,并出现管腔样结构。见图1。2.2dil-ac-ldl及胞膜的制备激光共聚焦显微镜结果显示,EPCs胞质摄取Dil-ac-LDL呈红色,胞膜结合FITC-UEA-1呈绿色,双染色阳性细胞呈橙黄色,为正在分化的EPCs。见图2。2.3epcs阳性率结果见图3,图3a为加入小鼠IgG二抗作为同型对照组,双阳性表达量极少,约1.1%。图3b示第2代EPCs,CD34阳性率70.2%,CD133阳性率74.8%,双阳性率69.3%。图3c示第2代EPCs,CD34阳性率38.8%,VEGFR-2阳性率59.8%,双阳性率39.2%。2.4胞器的检测透射电镜观察结果显示,EPCs表面有大量球状、指状或绒毛状突起,胞质内含有大量细胞器,包括线粒体、核糖体、粗面内质网和质膜小泡等,表明细胞代谢旺盛。此外,可见到内皮细胞特征性细胞器———Weible-Palade(W-P)小体,呈杆状,外附包膜,横切面可见细杆呈漩涡状排列,纵切面内有大量平行的细管包埋于基质中。见图4。3讨论3.1epcs的功能1997年Asahara等首次报道,人体外周血CD34+单核细胞可被动员到血管损伤处,具有向成熟内皮细胞分化的能力,不仅在胚胎期参与血管生成,而且在出生后还参与新生血管的形成。EPCs存在于骨髓、胚胎组织及脐带血中,以骨髓中的含量最高,且增殖能力强。骨髓单核细胞成分复杂,包括淋巴细胞、间质细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞及内皮祖细胞等。本实验中我们取3周龄的大鼠骨髓约1mL,经过约4周培养,可分离出足够数量的内皮祖细胞,细胞总数达106以上,能够满足后续研究的需要。3.2胎牛血清因子的培养在EPCs分离培养过程中,首先,掌握适当的单核细胞离心速度是关键。离心速度过快容易损伤细胞,细胞碎片增多,成活率降低,离心过慢则会使单核细胞与其他细胞相互混杂,细胞纯度降低。本实验采用2000r/min,离心30min,能最大限度地提高细胞成活率及纯度。其次,选用的培养基对EPCs至关重要。培养基中胎牛血清、血管内皮生长因子、碱性成纤维生长因子、胰岛素样生长因子-1,人表皮生长因子均不可缺少。其中,胎牛血清的质量及浓度非常重要,浓度最好选用5%~10%,<5%细胞摄取营养不足,生长缓慢,>10%则抑制细胞生长。然后,调整适当的单核细胞接种密度。干细胞的增殖与分化依赖于细胞之间的相互作用,适当的接种密度有利于细胞间相互促进生长,而不至于养分不足或产生接触抑制。当接种密度为105~106/cm2时细胞贴壁和分化最理想。此外,我们认为采取半量换液要比全量换液更能促进细胞生长,这说明细胞间可能分泌一些未知的细胞因子促进内皮祖细胞的生长与分化。最后,细胞的贴壁能力也极其重要。常用的促贴壁物质有纤连蛋白、明胶等,前者可增强细胞间、细胞与基质间的粘连,通过信号转导途径调节细胞骨架的形态,促进细胞铺展贴壁。但实验中我们发现,使用提前包被纤连蛋白的培养瓶培养EPCs,细胞贴壁太紧,消化传代时胰酶使用量增加且作用时间延长,细胞的损伤增加,细胞的形态和生物特性均受影响。因此本实验未使用纤连蛋白预处理细胞培养瓶。3.3骨髓单核细胞的分离纯化原代细胞主要通过形态学观察、特异性细胞标志、细胞功能等3方面进行鉴定。目前对EPCs的鉴定还存在争议,内皮系标志结合独特的形态学和功能特征,是当前多数学者鉴定这一功能性细胞群的主要方法。(1)细胞形态观察:我们在细胞培养中发现,48h内贴壁细胞在接种第3~5天,呈梭形甚至纺锤形散在分布于培养瓶底,第2~3周时出现生长高峰,第4周开始停止生长,并逐渐衰老死亡,这种细胞即早期EPCs;48h后贴壁细胞在传代培养第2~4周时呈现典型的铺路卵石样表现,第4~8周出现对数生长高峰,呈放射状生长,出现干细胞集落,可存活12周,此即为晚期EPCs。早期48h内贴壁细胞含有基质干细胞、成熟内皮细胞、成纤维细胞和EPCs等细胞成分,而晚期贴壁细胞主要是我们所需要的EPCs。(2)干细胞表面标志抗原鉴定:到目前为止,EPCs缺乏统一的细胞表面标志,在细胞生长的不同阶段,表面标志也不相同。目前,普遍认可CD34+、CD133+和VEGFR-2+等是内皮祖细胞的主要表面标志。本实验流式细胞术结果表明,CD133+的表达在造血干细胞或祖细胞的分化过程中逐渐丢失,可见CD133是一种区分早期EPCs与晚期EPCs的标志。在EPCs分化过程中,CD133表达逐渐降低,而CD34+的表达逐渐升高,并逐步开始表达成熟的内皮细胞表面标志,如VEGFR-2、VE-钙黏蛋白和vWF,表明EPCs逐渐向成熟内皮细胞分化。本实验结果中CD133阳性率先逐渐上升,然后降低,正说明EPCs向成熟内皮细胞方向分化。(3)细胞的吞噬功能:除了EPCs,内皮细胞、巨噬细胞等均可吞噬AC-LDL并结合UEA-1,所以荧光双染法鉴定也并非完全特异。从功能角度进行评估,激光共聚焦显微镜鉴定EPCs摄取Dil-acLDL,结合FITC-UEA-1的实验,说明该细胞具有内皮细胞功能。实验中我们在透射电镜下观察EPCs内部超微结构发现内皮细胞特征性细胞器—Weible-Palade(W-P)小体,它是一种外有被膜的杆状细胞器,存在于代谢旺盛的内皮祖细胞中,它多出现在