毛细管电泳法分离消旋体药物

毛细管电泳法分离消旋体药物

甲溴后马托英是一种抗胆红素药物，常用于眼科检查和成像。氧氟沙星是氟喹诺酮类广谱抗菌药。酮康唑为咪唑类抗真菌药,用于治疗浅表和深部真菌病。利阿唑是维甲酸代谢阻断剂,临床用于治疗前列腺癌、乳腺癌和慢性斑块型银屑病等疾病。卡维地洛是一个新型的非选择性β受体阻断剂,它能扩张血管起到抗高血压的作用。手性药物的对映异构体一般存在药理学、药效学和药动学的差异,因此其分离分析在药物质量控制等方面具有重要意义。环糊精及其衍生物在毛细管电泳法(CE)分离手性药物对映体中得到了广泛的应用。有文献报道,用阿米卡星在CE中对后马托品进行手性拆分,用三甲基-β-环糊精作为手性选择剂拆分氧氟沙星对映体,用硫酸化-β-环糊精拆分酮康唑对映体,用β-环糊精拆分卡维地洛对映体。尚未见文献报道利用毛细管电泳法对利阿唑进行对映体分离。作者首次以2-甲基-β-环糊精(2-O-M-β-CD)为手性选择剂,利用高效毛细管电泳法对上述5种手性药物进行了对映体分离研究。考察了背景电解质溶液pH值、手性选择剂浓度和缓冲盐浓度对分离的影响,并对分离机理进行了探讨。5种药物的化学结构式见图1。1河北东南角光导纤维厂CL1030高效毛细管电泳仪、HW-2000色谱工作站(北京彩陆科学仪器有限公司),未涂层熔融石英毛细管柱(河北永年光导纤维厂)。2-甲基-β-环糊精(2-O-M-β-CD,平均取代度为3,山东滨州智源生物科技有限公司),甲溴后马托品、氧氟沙星、酮康唑、利阿唑、卡维地洛对照品(中国药品生物制品检定所),三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸(分析纯,天津康科德科技有限公司),甲醇(色谱纯,天津康科德科技有限公司),水为二次蒸馏水(自制)。2实验条件及药物毛细管柱:石英毛细管(49cm×50μm,有效长度40cm);进样方式:重力进样,高度差10cm;进样时间:5s;分离电压:20kV;正极模式进样;甲溴后马托品、氧氟沙星、酮康唑、利阿唑、卡维地洛的检测波长分别为220、293、240、254、285nm;温度:室温。新毛细管柱用水冲洗5min,充满1.0mol·L-1NaOH溶液后放置2h进行活化,然后用水冲洗5min。实验开始前,依次用0.1mol·L-1NaOH溶液、水、背景电解质溶液冲洗10min。每2次运行之间用背景电解质溶液冲洗2min。背景电解质溶液的配制:称取Tris适量,用二次重蒸水溶解,用H3PO4调节至所需pH值,配成缓冲溶液。用缓冲溶液溶解适量2-O-M-β-CD即得背景电解质溶液。背景电解质溶液在使用前,经0.22μm微孔滤膜过滤,超声。消旋体药物的配制:分别精密称取各药物对照品适量,用少量甲醇溶解后,用水稀释成质量浓度约为1g·L-1储备液,冷藏备用。使用前量取该储备液适量,用背景电解质溶液稀释制成质量浓度约为0.5g·L-1溶液,经0.22μm微孔滤膜过滤后进样。3结果3.1缓冲液ph值的影响背景电解质溶液的pH值对分离度的影响是很复杂的,主要体现在不仅可以改变毛细管内表面硅羟基的解离程度从而影响电渗流的大小,也可以决定分析物的荷电情况,进而影响分析物的迁移行为。以30mmol·L-1Tris-H3PO4缓冲液(含30mmol·L-12-O-M-β-CD)为背景电解质溶液,在电压为20kV,室温的条件下,考察了缓冲液pH值在2.0～8.0内变化对分离度的影响。由于甲溴后马托品的pKa值为9.88,氧氟沙星的pKa值为7.60,酮康唑的pKa1值为6.50、pKa2值为2.90,利阿唑的pKa值为8.90,卡维地洛的pKa值为7.91,其电离程度及相应的电泳速度随pH值的降低而升高;但是,电渗流随pH值的降低而减小。分析物的表观迁移速度等于电渗流的速度与分析物自身的电泳速度之和。当二者和最小时,分析物的迁移时间最大,此时分析物的分离度达到最大。实验结果表明,甲溴后马托品和卡维地洛的最佳pH值为3.0,氧氟沙星、酮康唑和利阿唑的最佳pH值为2.0。结果见表1。3.22cd柔性的影响手性选择剂的种类和浓度是影响手性分离的重要因素。在分析物各自适宜的pH值条件下,分别考察了2-O-M-β-CD的浓度对分离度的影响。与β-CD相比,2-O-M-β-CD分子的口径和深度较大,且衍生化后的CD柔性增加,使主客体分子之间的相互作用点增加,作用力增强,更易与手性中心相连的原子发生相互作用。结果表明,在20～100mmol·L-1内,随着2-O-M-β-CD浓度的增加,手性药物的分离度先增大后减小。手性选择剂浓度太小,手性选择剂因不能与分析物形成有效的包合物而不能达到最佳分离效果;浓度太大时,由于手性选择剂对分析物两个单一异构体的作用差别减小,也不能达到最佳的拆分效果。2-O-M-β-CD的浓度为80mmol·L-1时,氧氟沙星的分离度最大;2-O-M-β-CD浓度为50mmol·L-1时,甲溴后马托品、酮康唑、利阿唑、卡维地洛的分离效果最佳。结果见图2。3.3缓冲溶液浓度在分析物各自的最佳pH值和最佳环糊精浓度的条件下,继续考察缓冲盐浓度对分离的影响。分离度随缓冲盐浓度增大先升高后降低。原因是缓冲溶液浓度的增大导致电渗流降低和溶液黏度的增大,使分析物迁移速度降低,与2-O-M-β-CD作用的时间也相应增加,所以分离度升高。但是,缓冲溶液浓度过大,会造成背景电解质溶液的离子强度过大,焦耳效应增大,分离度反而下降。因此,缓冲盐浓度为40mmol·L-1时,甲溴后马托品的分离效果最佳,其余4种分析物在缓冲盐浓度为70mmol·L-1时,达到满意分离。5种药物对映体分离的CE图谱见图3。3.4-o-m--cd分离苯环的能力CD环状分子中有特殊的空腔,可与相应立体大小的对映体形成包合物。在CE中,药物对映体与CD结合能力不同,导致所形成的包合物的淌度不同而分离。Armstrong等研究表明,CD对含有苯环的化合物尤其是手性碳附近含有苯环的化合物具有特异的对映体识别能力。在本文研究的5个化合物中,除卡维地洛外,其余4个化合物手性碳原子附近均含有苯环;因此,2-O-M-β-CD对甲溴后马托品、氧氟沙星、酮康唑、利阿唑4种化合物均表现出较好的分离能力。此外,药物手性中心附近含有羰基、羟基、胺基等官能团,它们能与CD分子中的羟基形成氢键,也对药物对映体分离起到重要作用。4对映射体分离以电中性环糊精衍生物2-O-M-β-CD为手性选择剂,对5种手性药物