活体滋养层细胞微粒的体外制备及鉴定

活体滋养层细胞微粒的体外制备及鉴定

癫痫最初是一种多发性的多基因性疾病，通常发生在妊娠中后期。它以高血压、尿便和水肿为特征。在严重的情况下，心力衰竭、肾衰竭、脑血管疾病和dic为特征。这是妊娠中独特的并发症，严重威胁着母儿健康。迄今,子痫前期的病因学和发病机制尚未明确。自1941年Young提出子宫缺血学说以来,现代胎盘缺血缺氧学说已经有了很大进展。目前认为子宫缺血的实质是子宫螺旋小动脉重铸过程发生障碍引起的胎盘或滋养层细胞缺血,缺血再灌注损伤产生的毒性因子进入母体血液循环,损伤内皮细胞的功能,患者临床表现为子痫前期。近年来,由胎盘表面新陈代谢产生的妊娠期特有的循环微粒STBM得到了人们的关注。然而,虽然STBM可以在母亲血样本中检测到,但是却不能分离用于体外实验。本研究经过一段时间的摸索,建立了一种STBM的体外制备方法。数据和方法1.样品收集正常足月健康剖宫产孕妇胎盘娩出后立即置于4℃预冷含1%青链霉素的无菌PBS中,20分钟内送至实验室。2.人类睾丸中bca蛋白表达情况JAI1003电子分析天平(上海天平仪器厂),CP100MX超速冷冻离心机(日立),青链霉素溶液(GIBCO),BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海钰森生物技术有限公司),人类胎盘碱性磷酸酶ELISA试剂盒(GBD)等。3.小鼠血液中的ca取足月正常胎盘母体面2/3绒毛组织,去除蜕膜,剪成2cm×2cm×2cm大小,分别用0.1mol/L的CaCl2和PBS洗涤3次去除血液,再将组织剪成5mm大小的碎片,放入100ml的0.15M的NaCl中,4℃搅拌过夜。弃去组织,收集上清液。采用三步离心法,先1000g离心10min,去除大的细胞碎片,收集上清液10000g离心10min,去除线粒体及小的残存的细胞碎片,再收集上清液100000g离心60min,最后得到的乳白色沉淀即为合体滋养细胞微粒,沉淀重复洗涤离心2次,悬浮于1ml的无菌PBS中,-80℃保存待测。4.stbm制剂及相应罪犯palp的测定以胎盘碱性磷酸酶(placentalalkaline-phosphatasePALP)作为膜标志酶,采用酶联免疫分析法检测STBM制剂及相应胎盘组织的PALP含量。睾丸中palp蛋白的表达正常健康剖宫产孕妇胎盘中PLAP含量为56μg/ml,由其制备而来的STBM中PALP含量为900μg/ml,STBM与胎盘组织PALP的含量比值显示,STBM的PLAP蛋白表达水平是相应胎盘组织的16.07倍。子痫前期患者血清中stbm的变化情况在生理或者病理状态下,真核细胞通过膜脱落释放囊泡到环境中形成微粒,其大体结构分为膜和膜内容物。微粒的膜主要由脂类和蛋白质组成,其成分取决于微粒的起源细胞和微粒的形成过程。微粒的膜为双层磷脂,表面有源自亲代细胞的特异膜抗原,可用来鉴别微粒的来源。最近的研究发现,微粒不只是简单的细胞脱落物,而是具有多种重要生物学信息的“载体”以及携带有多种生物学活性的分子,可参与炎症、感染、血栓、自身免疫疾病以及心血管疾病的发生。其中,由于胎盘表面新陈代谢,凋亡的合体滋养层细胞受调控地释放亚细胞微粒,脱落至母体血液循环产生的STBM得到了人们的关注。STBM是妊娠期特有的循环微粒,从妊娠26天起,估计每天有10万个合体滋养层细胞微粒从绒毛表面掉下进入母体血液循环,随着妊娠的进展,胎盘滋养层细胞不断增殖和凋亡进行组织结构重建,胎盘体积增大,STBM脱落也增加。正常妊娠妇女及子痫前期患者的血浆中均可以检测到STBM,但后者血浆中的表达水平更高。早发型子痫前期以及存在胎儿宫内生长受限但血压正常的孕妇中均有胎盘凋亡和/或坏死的增加,Goswami等通过比较两者血浆中STBM水平,发现STBM浓度的增加仅存在于前者,以此来说明STBM的浓度变化对于子痫前期患者来说是特异性的。临床发现相对于晚发型子痫前期而言,早发型子痫前期患者中不良母儿结局的发生率较高。陈宇等研究发现,早发型重度子痫前期患者血浆中STBM水平明显高于晚发型重度子痫前期患者血浆STBM浓度。Aly等也发现重度子痫前期患者血清中STBM的降解产物组织多肽抗原(TPA)水平明显高于轻度子痫前期患者血清中TPA水平。表明STBM参与子痫前期的发病过程,并且与该疾病的严重程度有关,可能参与子痫前期全身性炎症反应及内皮细胞的损伤。虽然STBM可以在母体血液样本中检测到,但是却不能从中分离用于体外实验。为了进一步研究STBM与子痫前期发病的关系,我们必须体外制备出接近于子痫前期患者胎盘病理性释放的STBM。在体内,有两种途径可以产生微粒:细胞激活和凋亡。细胞受到刺激时,胞质Ca2+浓度升高,导致磷脂酰丝氨酸外化,细胞膜重塑。胞质Ca2+浓度增高还能激活钙蛋白酶,其能裂解细丝蛋白与肌球蛋白,破坏细胞膜的正常细胞骨架结构,从而使细胞出芽形成微粒。细胞凋亡与细胞激活产生微粒的机制不同。细胞凋亡的特征主要是细胞收缩,DNA片段化及动力性的囊泡突起。子痫前期时,由于滋养细胞浸润不足,影响子宫螺旋动脉重铸,胎盘血管重铸不良,引起胎盘灌注减少,胎盘缺血是子痫前期发病中的一个重要因素,胎盘组织严重的缺血所导致的坏死而非凋亡,使得合体滋养层细胞释放STBM增多。Gupta等采用绒毛组织培养法以及胎盘小叶灌注法体外制备STBM,结果发现由这两种方法制备得到的STBM更接近于生理情况下胎盘释放的STBM。而体外实验目的是研究STBM与子痫前期的关系,故制备更接近于子痫前期病理状态下胎盘释放的STBM用于科研更具有说服力。本实验中,我们模仿体内正常细胞骨架结构被破坏产生微粒的方法,将胎盘组织采用机械方法打碎,然后采用差速离心法分离纯化得到STBM。差速离心法的原理是多次运用不同离心速度将大小和密度不同的细胞、细胞碎片以及大分子化合物、聚集物等分级分离,我们采用三步离心法,将线粒体以及小的残存细胞碎片除去,最后得到STBM。Carlson等采用蔗糖密度梯度离心法(Carlson法),即用蔗糖溶液预先在离心管内制备出密度梯度,再在其上面加上一层少量的STBM初提溶液,应用超速离心机离心后收集梯度界面上的STBM成分,并以5′-核苷酸酶和胎盘碱性磷酸酶作为膜标志酶,检测STBM与胎盘的5′-核苷酸酶和胎盘碱性磷酸酶活性,比较酶的富集度以确定STBM的纯度,发现该法可使膜纯化10-20倍。本研究制备的STBM较相应胎盘组织纯化了16.0倍,与Carlson法相符。另外,国外学者还采用流式细胞术及免疫磁珠技术分离和纯化STBM,此两种方法能获得较高纯度的STBM,但对设备要求高,费用昂贵,普通