用差速离心法制备油菜种子微粒体及微粒体蛋白浓度测定

用差速离心法制备油菜种子微粒体及微粒体蛋白浓度测定

油菜是中国的重要油食动物之一。含油量和脂肪酸的组成是关系到油味素质量优良的重要指标之一。由于多不饱和脂肪酸如亚油酸(18∶2)、亚麻酸(18∶3)等易氧化的缺点,人们希望提高油菜单不饱和酸如油酸(18∶1)的含量。在亚油酸和亚麻酸的合成过程中,内质网Δ12-脂肪酸去饱和酶(FAD2酶)的活性尤为重要,因为它负责向位于内质网的单不饱和脂肪酸中引入第2个双键,是多不饱和脂肪酸合成的第一步也是关键的一步。它存在于内质网膜上,微粒体是在制备真核细胞匀浆时形成的囊泡微粒,由破碎的内质网形成。因此,油菜种子微粒体的制备是对油酸脱氢酶进行深入研究的前提。目前,微粒体的研究范围多集中于哺乳动物(人、大鼠和小鼠),油菜种子微粒体制备方法的研究尚未见报道。笔者采用差速离心法制备油菜种子微粒体,并对其蛋白浓度进行检测,以期为油菜种子油酸脱氢酶的深入研究奠定基础。1材料和方法1.1高油酸油酸盐系表面活性剂油菜种子于2009年10月在湖南农业大学油料作物研究所科研基地进行播种,于2010年4月对高油酸、低油酸2个品系进行人工授粉,挂牌标记,在授粉后47d进行取样。取样时快速剪下角果,置于50ml带塞离心管中,马上投入液氮罐,带回实验室后迅速置于-70℃超低温冰箱保存。1.2仪器、试剂和试药AR2140电子分析天平(OHAUS,USA);高速离心机(Beckman,Germany);Ultra-turraxT8组织匀浆机(IKA,Germany);8453紫外-可见分光光度计(Agilent,USA);超低温冰箱(-80℃);超速离心机(Beckman,Germany);pH计;真空干燥箱;超声波清洗机;制冰机;牛血清蛋白(Sigma公司);Tris缓冲液、EDTA、DTT、HEPES、硫酸镁、乙醇、蔗糖、盐酸、磷酸、考马斯亮蓝、山梨醇等试剂均为国产分析纯。所用试剂溶液均按照文献方法配制。1.3设备剪刀、烧杯、量筒等常用器具。1.4优先处理和微粒准备1.4.1山梨醇提取液hepesi将油菜角果从超低温冰箱中取出,立即迅速去掉角果,将约3g种子剥出,精确称量其重量,放入研钵中,加入分离提取缓冲液HEPES(pH7.2,包含50mmol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸、0.6mol/L山梨醇,40mmol/L抗坏血酸钠、1mmol/LNa2EDTA,1mmol/LMgSO4,配制过程在4℃进行)4℃研钵(预冷)中充分研磨,直到每粒种子的种皮脱落为止。1.4.2沉淀-过渡系统弃去上清液后,加入缓冲液,在冰浴中匀浆20s,重复2次。将匀浆液转移至具塞离心管中,以10000×g离心10min,得到上清液,再转入新离心管中,于100000×g超速离心60min(4℃),弃去上清液,得到沉淀。沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH7.6,包含Tris-HCl50mmol/L,Na2EDTA1mmol/L,二硫苏糖醇1mmol/L)重新悬浮。分装后,于-70℃冻存。1.5测定了油种子总蛋白的含量1.5.1标准溶液的配制①标准蛋白溶液的配制:精确称取牛血清白蛋白5mg,用蒸馏水定容至10ml,配成500μg/ml的标准溶液。②考马斯亮蓝G-250溶液的配制:精确称取考马斯亮蓝G-250100mg,溶于50ml95%乙醇,再加入120ml85%磷酸溶液,稀释定容至1000ml备用。1.5.2测波长的确定在试管中分别精确移取牛血清白蛋白标准溶液0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35和0.40ml,加蒸馏水稀释至0.4ml,然后在各试管中分别加入4.0ml考马斯亮蓝G-250溶液,摇匀,室温下反应5min,在595nm波长处测定吸光度。以牛血清白蛋白标准溶液浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。1.5.3精密度、准确度配制高、中、低3种浓度(500、250、125μg/ml)牛血清白蛋白溶液,1d内每个浓度测定5个时间点,每个时间点每个浓度测定吸收度3次,计算日内精密度;连续5d每个浓度每天测定吸收度3次,计算日间精密度。1.5.4蛋白浓度的测定分别取上述1.4.2制备的匀浆样品,高油酸材料与低油酸材料各2份,每份20μl,加水稀释至0.4ml,然后加入4.0ml考马斯亮蓝G-250溶液,摇匀,室温下反应5min后进行蛋白浓度的测定,测定样品吸光度,代入其回归方程中,计算油菜种子微粒体中蛋白浓度。2结果与分析2.1线性关系考察由图1可知,牛血清白蛋白浓度与吸收度在0～500μg/ml范围内线性关系良好,其回归方程为:Y=0.00134X+0.064(r=0.9963)。2.2表1显示了精密度测试的结果，它们可以满足生物样品分析的要求2.3低油酸材料种子微粒体的蛋白浓度高油酸材料种子微粒体的蛋白浓度为405.7μg/ml,而低油酸材料种子微粒体的蛋白浓度仅为335.1μg/ml。由此可见,由表2可知,高油酸材料发育过程中相同质量的种子提取出的微粒体蛋白平均含量要高于低油酸材料。3种子活性的测定植物体内的脱氢酶大多难被提取,难以用传统的生物化学方法对它们进行研究。油酸脱氢酶FAD2(EC1.3.1.35,1-酰基-2-油酰基-sn-甘油-磷酸胆碱脱氢酶)是植物产生多聚不饱和脂肪酸的关键酶,它存于内质网膜上,以1-酰基2-油酰基-sn-甘油-磷酸胆碱为底物,需氧条件下以NADH为还原剂,生成多聚不饱和脂肪酸、亚油酸(Cis9,12-18:2)和α-亚麻酸(Cis9,12,15-18:3),它们在植物的膜系统中主要以酯化的形式存在,因此,测定油菜种子微粒体中蛋白浓度是油酸脱氢酶系活性测定的重要基础。该试验采用Bradford法测定油菜种子微粒体蛋白浓度,并进行了精密度试验,结果良好。目前其他植物微粒体的制备主要采用差速离心法,其基本原理是建立在不同大小和密度的颗粒在不同速度的离心场中沉降速度存在差别的基础上。传统的方法是在低速对匀浆液进行2次离心,第1次去掉叶绿体,第2次去掉线粒体。该试验对此进行了改进,采用了1次高速离心的方法去除上述组分,