人血浆中酮康唑的药动学及生物等效性研究

人血浆中酮康唑的药动学及生物等效性研究

酮康唑是一种广泛的抗真菌药物，通过抑制真菌麦角酸乙醇的生物合成，改变膜厚醇的组成，达到抗真菌的效果。酮康唑片临床上已使用多年,《中国药典》已经收录。我公司研制的酮康唑片属化学药物6类,按照《药品注册管理办法》的规定,对研制的酮康唑片进行人体药代动力学和生物等效性研究。酮康唑在人及动物体内的药代动力学研究,国内已有报道,均采用高效液相色谱法进行血药浓度测定。受紫外检测器灵敏度的限制,这些方法或采用较繁杂的前处理过程以达到浓缩样品的目的,或增加血浆样品的取用量来增加灵敏度。例如,马张庆、刘松青、王蕾、任志红等均在沉淀蛋白或有机溶剂提取后将上清液吹干,再用流动相复溶。陈绳林等涉及3次有机溶剂提取,再合并上清液、吹干、复溶。在转移上清液、吹气及流动相复溶的过程中可能引起样品的损失或交叉污染,从而使方法的灵敏度或准确性受到影响。黄成坷、傅军均需取用1mL血浆样品,且最低定量限仅0.25μg·mL-1,可能造成部分样品浓度无法检测,最终影响药代动力学参数的估算。本试验建立了人血浆中酮康唑的HPLC-MS法,可快速、灵敏、准确地测定血浆中酮康唑的浓度。通过观察健康受试者口服参比及受试酮康唑片后酮康唑的血药浓度经时变化过程,估算相应的药代动力学参数,进行人体生物利用度和生物等效性评价,为临床用药提供参考依据。1材料表面1.1在线进样和质谱Agilent高效液相色谱-质谱联用仪,含二元泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱及四极杆质谱检测器、AgilentChemstationB.02.01色谱处理软件;MettlerDelta320酸度计。1.2药物、试剂、仪器酮康唑对照品(中国药品生物制品检定所,批号:0294-9801);地西泮对照品(内标,中国药品生物制品检定所,批号:171225-200302);受试制剂为酮康唑片(南京长澳制药有限公司生产,规格:每片含酮康唑200mg,批号:20051101);参比制剂为里素劳(NizoralTM,西安杨森制药有限公司生产,每片含酮康唑200mg,批号:050118052)。甲醇、冰醋酸(色谱纯,美国TEDIA公司);乙酸铵(分析纯,南京化学试剂一厂);试验用水为去离子水。2方法2.1仪器和质谱条件色谱柱:迪马C18柱(150mm×4.6mmi.d.,5μm);柱温:30℃;流动相:甲醇-10mmol·L-1醋酸铵溶液(冰醋酸调节pH至3.5)(72∶28,v/v);柱后分流,流速为0.3mL·min-1。质谱参数:选择性离子检测(SIM);离子化方式:气动辅助电喷雾离子化;离子极性:正离子;检测离子:酮康唑[M+H]+m/z:531.0,地西泮[M+H]+m/z:285.0;传输区电压:70V;干燥气流速:5L·min-1;雾化室压力:60psig;干燥气温度:300℃。2.2对照品贮备液的制备精密称取酮康唑对照品适量,置100mL量瓶中,甲醇溶解并定容,得贮备液(约含400μg·mL-1酮康唑),4℃保存,临用前以甲醇逐级稀释成所需浓度的标准溶液。精密称取地西泮对照品适量,置100mL量瓶中,甲醇溶解并定容,得浓度约为200μg·mL-1的贮备液。精密吸取5mL,置50mL量瓶中,甲醇稀释至刻度,得浓度约为20μg·mL-1的地西泮(内标)溶液,4℃保存。2.3内标溶液配制冷冻血浆于37℃水浴融化,涡旋15s,从中精密吸取0.2mL,置1.5mLEppendorf管中,精密加入内标溶液10μL,涡旋混匀,加入甲醇0.8mL,涡旋3min混匀,于16000r·min-1离心10min;取上清液0.8mL,于16000r·min-1再次离心10min,吸取上清液20μL进行HPLC-MS分析。3药代动力学研究与生物等效的评价3.1药品临床试验20名男性健康受试者,年龄为19～25岁,体重为60～78kg,身高为169～185cm。常规体检及生化检验结果表明肝、肾功能,心电图均无异常,精神状态良好。受试者在试验前对试验目的及要求完全了解,并签署知情同意书。本试验经中国医学科学院皮肤病医院国家药品临床试验机构伦理委员会批准后进行。受试者在试验前2周及试验期间未服用其它药物,试验期间避免饮用酒类和咖啡类饮料,统一饮食。本试验采用两制剂双周期交叉试验设计(two-periodcrossoverdesign),20名男性健康受试者随机分为A、B两组。第一周期试验A组口服受试制剂1片,B组口服参比制剂1片,间隔7天清洗期后,两组交换服药品种进行第二周期试验。试验工作在中国医学科学院皮肤病医院Ⅰ期临床观察室中进行,受试者由临床医生监护,受试期间发生任何不良反应均及时处理和记录。受试者禁食过夜后,次日早晨空腹服用受试制剂或参比制剂。受试者于服药前和服药后0.167、0.25、0.333、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、5、7、9、13、24h分别采集静脉血3mL,置肝素抗凝试管中,3000r·min-1离心分离出血浆,于-20℃冰冻保存。3.2药代动力学参数采用DAS2.0软件对受试者的血药浓度-时间数据进行处理,采用非房室模型估算受试制剂与参比制剂中酮康唑的主要药代动力学参数。达峰时间tmax和峰浓度Cmax为实测值。Cmax和AUC经自然对数转换后进行方差分析和双单侧t检验,tmax采用非参数法(Wilcoxon符号秩检验)进行统计。4试验结果4.1方法研究4.1.1加对照品与受试者口服酮康唑片后血浆样品的色谱图考察了6个来自不同个体的空白血浆样品,测得空白血浆(A)、空白血浆加对照品(B)和受试者口服酮康唑片后血浆样品(C)的典型色谱图,如图1所示。酮康唑的保留时间约为4min,内标地西泮的保留时间约为4.3min,酮康唑及内标峰形良好,内源性物质对测定无干扰。4.1.2加权线性回归精密吸取空白血浆0.2mL,分别加入酮康唑标准溶液,配制成酮康唑浓度分别为0.05、0.201、0.503、2.01、5.03、10.05、20.11μg·mL-1的血浆样品,旋涡30s混匀,每一浓度各制备5份,按上述“血浆样品处理方法”,自“精密加入内标溶液10μL”起依法操作。以酮康唑峰面积As与内标峰面积Ai的比值f(f=As/Ai)对酮康唑浓度C进行加权线性回归,权重系数为1/C2,得回归方程:f=0.3256C-0.0066,r=0.9998。酮康唑浓度在0.05～20.11μg·mL-1的范围内与色谱响应线性关系良好,最低定量限为0.05μg·mL-1。4.1.3实测浓度测定按标准曲线配制方法分别配制含酮康唑浓度为0.05、2.01、10.05μg·mL-1的血浆样品,每一浓度各5份,按上述“血浆样品处理方法”,自“精密加入内标溶液10μL”起依法操作,每天配制1批样品及1条标准曲线,连续做3天,共3批样品。将酮康唑峰面积As和内标峰面积Ai的比值f带入相应随行标准曲线计算实测浓度。实测浓度的RSD即为精密度,实测浓度与加入浓度的比值即为准确度,结果表明酮康唑低、中、高浓度的批内及批间变异均小于15%,准确度均在85%～115%的范围内(见表1)。4.1.4内标峰面积比分析分别配制含酮康唑浓度为0.05、2.01、10.05μg·mL-1的含药血浆样品及标准溶液对照样品,经处理后进样分析,测得酮康唑与内标的峰面积比。计算结果显示:在3种浓度下,血浆中酮康唑的提取回收率分别为:109.3%、100.4%、101.5%。4.1.5冻融法处理按标准曲线配制方法分别配制含酮康唑浓度为0.05、2.01、10.05μg·mL-1的血浆样品,于室温放置4h、反复冻融3次及处理后20℃放置12h的条件下考察样品稳定性,与立即处理进样的样品进行比较,结果表明在上述条件下各浓度的酮康唑稳定性均良好。4.2血药浓度结果20名健康受试者分别口服相同剂量受试制剂和参比制剂后,血浆中酮康唑的平均血药浓度-时间曲线如图2所示,图中每一点均标明了数据的分散程度(±SD)。主要药动学参数见表2。4.3u3000添加mta和lnauc0-24,8.将主要药动学参数经对数转换后进行方差分析,两制剂的AUC和Cmax均无显著性差异,进一步采用双单侧t检验和(1-2α)%置信区间法进行分析,AUC和Cmax均拒绝无效假设,lnCmax和lnAUC0-24的90%置信区间分别为85.4%～100.4%和89.9%～99.9%,符合生物等效性要求。tmax采用非参数法(Wilcoxon符号秩检验)进行统计,结果显示tmax无显著性差异(P>0.05)。根据相关判定标准可认为受试制剂与参比制剂在吸收速度和吸收程度上具有生物等效性。5[m+h]+m/z:331.0的离子响应在优化流动相组成时发现,酮康唑的保留时间与流动相pH值关系密切,因此可通过冰醋酸的加入调节流动相pH值,使酮康唑的保留时间前移至4min左右,从而在避免基质和内源性物质干扰的前提下缩短分析时间。水相中加入冰醋酸的另一个好处是使酮康唑的[M+H]+m/z:531.0的离子响应增加,提高方法的灵敏度。在流动注射分析(FIA)的模式下,对传输区电压、干燥气流速和干燥气温度进行了快速优化,发现[M+H]+m/z:531.0的离子的响应受传输区电压影响较显著,优化结果见“2.1高效液相色谱-质谱测定条件”部分。确定上述条件后对内标物质进行考察,地西泮保留时间与酮康唑相近,