念珠菌对两性霉素b、酮康唑和克霉唑的药物敏感性分析

念珠菌对两性霉素b、酮康唑和克霉唑的药物敏感性分析

菌属，又称假丝菌，是人体的正常菌之一，存在于口腔、呼吸道、肠道和阴道粘膜上。当机体发生菌群失调或抵抗力低下时,可引起各种念珠菌病。近年来由于临床上广谱抗菌药物、激素和免疫抑制剂的广泛应用,以及恶性肿瘤、血液病及器官移植等免疫功能低下疾病导致深部真菌感染率呈持续上升趋势。因此,本研究试图通过对较大样本临床标本进行念珠菌属真菌的分离和鉴定,并采用国际主流的CLSIM27-A2方案对念珠菌属进行药敏监测,以期获得准确的念珠菌属真菌流行病学资料,借以了解念珠菌感染和耐药的现状,为临床抗真菌药物的选择提供合理依据。1材料和方法1.1材料表面1.1.1患者标本分离收集南昌大学第一附属医院2005年8月—2010年7月临床各科室送检的尿液、阴道分泌物、痰、血、大便等其他部位标本,从中分离出念珠菌1214株。质控菌株为克柔念珠菌ATCC6258和近平滑念珠菌ATCC22019。1.1.2有阳性菌落的分离纯化将标本直接接种于沙氏培养基(SDA),选择所有阳性菌落进行2次分离纯化。采用念珠菌显色培养基(广州辉康公司)、Vitek2YST鉴定条(法国生物梅里埃公司)方法进行念珠菌临床菌株鉴定。1.2临床菌株的微稀释药敏试验1.2.1nacl溶液法将受试菌在沙氏琼脂平板上转种3次以保证其纯度和活力,35℃孵育24h,挑取大于lmm菌落3~5个至5mL无菌的8.5g/LNaCl溶液中,旋摇制成均匀的菌悬液,用NaCl溶液调整浊度达1×l06~5×l06CFU/mL。1.2.2抗菌设施的测定将3种抗生素贮存液倍比稀释为10个浓度,以微量加样器从低到高依次将药液加入无菌的96孔U型微量滴定板内,每孔100μL,第11孔为菌液阳性对照,第12孔为无药空白对照,封口胶密封,-20℃保存备用。1.2.3添加梁按照美国临床试验标准化研究所(CLSI)推荐的(M27-A2)方案的微量稀释法进行,将1×l06~5×l06CFU/mL菌悬液用RPMI1640培养基稀释1000倍,加入制备好的MIC测定板中,每孔100μL,菌液终浓度为0.5×103~2.5×103CFU/mL。35℃孵育48h,观察结果。1.2.4药物敏感试验参照CLSIM27-A2方案,3种抗真菌抗生素对念珠菌的最低抑菌浓度(μg/mL)判定标准:与对照孔按下列标准比较“0:肉眼观察清亮无混浊;1:轻度模糊;2:浊度显著减低;3:浊度轻度减低;4:浊度不减低”。结果判定:酮康唑、克霉唑以浊度显著降低为MIC终点,而两性霉素B以肉眼观察清亮无混浊为MIC终点。药物MIC敏感度和耐药解释标准两性霉素B≤1μg/mL;酮康唑≤0.125μg/mL;克霉唑<0.5μg/mL为敏感(S)。酮康唑0.25~0.5μg/mL为剂量依赖敏感(S-DD)。两性霉素B>1μg/mL;酮康唑≥1.0μg/mL;克霉唑≥0.5μg/mL为耐药(R)。重复3次取平均值计算该菌的MIC值,然后根据结果计算敏感和耐药的百分率。2结果2.1克柔菌及其他分离自痰液的鉴定2005年8月—2010年7月期间共收集南昌大学第一附属医院念珠菌1214株。如表1所示,1214株念珠菌中,白念珠菌862株,占71.0%;光滑念珠菌195株,占16.1%;热带念珠菌68株,占5.6%;克柔念珠菌42株,占3.5%;近平滑念珠菌14株,占1.2%;其他念珠菌33株,占2.7%。念珠菌主要分离自痰液标本(660株,54.4%)和阴道分泌物(365株,30.1%),在大便中也分离到23株念珠菌,占1.9%;分离自无菌部位的念珠菌较少,尿液113株,占9.3%,血液25株,占2.1%,腹水和胸水分离9株念珠菌。其他标本29株,占2.43%。白念珠菌在痰液、阴道、大便等标本中检出率较高,所占比例分别为79.7%、66.8%和52.2%;而在无菌部位(尿液、血液、腹水和胸水)中,主要分离出非白念珠菌,占55.5%,白念珠菌仅占44.5%。2.2合成药物的副作用2.2.1菌材敏感试验结果1214株念珠菌对两性霉素B、酮康唑和克霉唑等3种抗真菌药物的敏感率分别为:65.8%、41.2%和49.7%;耐药率分别为34.2%、32.7%和50.3%;MIC90分别为4、8和2μg/mL。其中,近平滑念珠菌对两性霉素B的敏感率较高,为92.9%;各类念珠菌对酮康唑的敏感率均低于50%;而除白念珠菌和近平滑念珠菌外,其余种类念珠菌对克霉唑的耐药率都高于50%。2.2.2真菌体外药敏试验结果1214株念珠菌分别来自临床各科室送检的痰、阴道分泌物、尿液、大便、腹水、血液和胸水等标本。在临床用药中,念珠菌感染的部位被作为选择抗真菌药物种类的原则之一,为了给临床用药提供更有利的参考依据,本实验研究了不同种类菌株在不同感染部位的药敏情况。我们将痰、阴道分泌物、大便归类于有菌部位标本,而尿液、血液和胸腹水则归于无菌部位标本。还有极少部分标本其来源部位尚不明确,因此不将这类标本归类。体外药敏结果显示:来自有菌部位标本的念珠菌对两性霉素B、酮康唑和克霉唑的敏感率分别为:65.0%、39.7%和50.2%。而在无菌部位,念珠菌对两性霉素B、酮康唑和克霉唑的敏感率分别为:71.4%、42.6%和48.3%。3真菌体外药敏试验念珠菌是能够侵犯皮下组织、黏膜和内脏,引起全身性感染的条件致病性真菌,共有81个种。其中白念珠菌是临床上最常见和最主要的致病菌。近年来大量研究表明非白念珠菌引起的感染也日趋增加,这种白念珠菌向非白念珠菌变迁的趋势引起人们越来越多的关注。本研究中,白念珠菌是最主要的致病菌,主要分离自痰液、阴道分泌物及大便等有菌部位,所占比例分别为79.7%、66.8%和52.2%。值得注意的是,本研究中非白念珠菌在血液感染中所占比例为76.0%,高于国内外文献报道结果,这说明非白念珠菌血症有所增加。本实验中,我们采用CLSIM27-A2方案对所有菌株进行三种药物敏感实验,此方案虽然操作过程比较繁琐,价格昂贵,但结果准确可靠,可比性强。而且CLSIM27-A2方案是国际上对念珠菌进行药敏实验的主流研究方法,便于与国外其他研究结果进行比较。目前,国内临床上常用的真菌体外药敏试验方法为纸片扩散法(如ROSCO)和浓度梯度(Etest)法,较少采用CLSIM27-A2方案。尽管这两种实验方法操作简单,广泛应用于临床,但同CLSI液基稀释法M27-A2的结果并不完全一致。唑类抗真菌药物,如酮康唑、克霉唑、氟康唑等,具有吸收好、生物利用度高、不良反应少和安全可靠等优点,是临床上预防和治疗念珠菌病的首选药物。两性霉素B,能与细胞膜上的麦角甾醇结合,破坏细胞膜通透性,从而导致真菌的死亡,是另一类常用的抗真菌药物。本研究药敏试验结果显示,1214株念珠菌对酮康唑和克霉唑的耐药率高达32.7%和50.3%,高于2000年国内外文献报道;本研究中,热带念珠菌对克霉唑的耐药率最高,达到70.6%;其次为光滑念珠菌和克柔念珠菌,克霉唑的耐药率分别为61.1%和57.1%。对两性霉素B而言,文献中报道,2004年和2007年念珠菌的耐药率小于10%,而在本研究中却升高至34.2%。此外,1214株念珠菌对两性霉素B、酮康唑和克霉唑的MIC90也高于2005年国内文献报道结果,分别为:4、8和2μg/mL。可见,念珠菌对两性霉素B、酮康唑和克霉唑的耐药率与往年相比有所升高。目前,临床抗真菌药物治疗策略主要针对分离的菌种,而对菌种的感染部位考虑甚少。本研究进一步对不同感染部位的各菌种耐药性进行分析,结果显示,来自有菌部位的念珠菌对两性霉素B的耐药率为35%,除克柔和近平滑念珠菌外,其余菌株耐药率均高于无菌部位菌株耐药率;不同来源部位的念珠菌对酮康唑的耐药率也不同,其中以有菌部位的白念珠菌耐药率最高,为36.7%,光滑、热带念珠菌的耐药率分别为27.7%和25.5%,而分离自无菌部位的念珠菌对酮康唑的耐药率相对较低,可见,念珠菌对酮康唑耐药主要来自有菌部位;相反,在对克霉唑的耐药率分析中,无菌部位白念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌的耐药率分别为:48.5%、75%和33.3%,均高于有菌部位菌株耐药率。所以临床上在选择治疗方案时不仅需要考虑感染的真菌菌种,受感染部位也是重要因素。我们首次报道的这个发现对于临床治疗