不同冷冻方法对小鼠卵母细胞抗冻能力的影响

不同冷冻方法对小鼠卵母细胞抗冻能力的影响

小鼠是现阶段最重要的实验动物。关于卵母细胞的冷冻保存技术，可以结合体外受精、胚胎移植、克隆、转移和胚胎移植等技术，为临床和生产实践服务，为人类相关研究建立实验模型。冷冻保存小鼠卵母细胞的研究开始于20世纪50年代。1977年,Whittingham首次报道了冷冻保存MⅡ期卵母细胞体外受精移植后产仔。1989年,Nakagata用玻璃化冷冻保存的小鼠卵母细胞,体外受精胚移植后产仔率达45.8%。与成熟卵母细胞相比,未成熟卵母细胞的冷冻更为困难。1990年,Schroeder等用不同方法冷冻保存小鼠生发泡期(GV)的卵母细胞,解冻后大部分卵母细胞能体外成熟,但体外受精后仅9%～17.3%发育到两细胞。1994年,超低温冷冻保存小鼠GV期卵母细胞的研究取得了突破,并获得了后代。本试验通过对2种冷冻保存方法(程序化冷冻和玻璃化冷冻)、2种冷冻保护剂(甘油和DMSO)、2个不同时期(GV期和MⅡ期)卵母细胞的冷冻效果的比较研究,试图以此为基础探索一种简单、高效的冷冻-解冻保存体系,为进一步提高小鼠卵母细胞冷冻保存效果提供理论基础和技术途径。1.1hvm/dmso常规冷冻保护液:PBS+20%NCS+10%甘油。玻璃化基础液(HoldingMediumsofVitrification,HMV):PBS+0.5mol/L蔗糖+20%NCS。玻璃化冷冻液:A1为HMV+6.25%DMSO,A2为HMV+40%DMSO;B1为HMV+6.25%甘油、B2为HMV+40%甘油。解冻液:A为HMV+6.25%DMSO、HMV+3.125%DMSO;B为HMV+6.25%甘油、HMV+3.125%甘油。1.2卵巢组织病理学检测取20g左右雌性昆明小白鼠(青龙山实验动物场)6只。腹腔注射PMSG(10U/只),48h后,3只脱颈椎处死取卵巢,用4#针头或自制钟表镊刺破卵巢取GV期卵母细胞;另3只腹腔注射HCG(10U/只),15h后脱颈椎处死,取输卵管壶腹部,用4#针头或自制钟表镊撕破壶腹部取MⅡ期卵母细胞。1.3母细胞的冷冻和解冻将获取的GV期卵母细胞或MⅡ期卵母细胞进行冷冻,比较其差异。1.3.1降温细管和冰液卵母细胞(GV期)先在37℃PBS液中洗涤3次,后在常规冷冻液中平衡10min,再分3段装入细管中。将细管放入程序冷冻仪内降温。程序设定为:以最大功率从室温降至15℃,平衡10min,再以1℃/min速率从15℃降到-7℃,植冰,停留10min;然后以0.3℃/min速率降到-35℃,迅速转入液氮罐中保存。1.3.2嵌入2液氧，液滴不同时的涤纶卵母细胞(GV期或MⅡ期)在37℃PBS液中洗涤3次后移入A1液滴或B1液滴,平衡3min。然后移入A2液滴或B2液滴中,分3段装管,中间一段含卵母细胞,用聚乙烯醇粉末封口,立即投入液氮中保存。1.3.3振动、剪去两端塞子从液氮中取出细管,在空气中停留10s后,投入37℃温水中轻轻振动10s,剪去两端塞子,使内容物流入到培养皿中。在显微镜下检出卵母细胞,依次移入含6.25%、3.125%和无冷冻剂的解冻液,每步均需平衡5min,以脱去冷冻保护液。1.4胞菌回复突变试验,清髓率随时间的变化,幼血率统计细胞因子检测显微镜下观察,把卵丘细胞未脱落、透明带完整、胞质均匀的卵母细胞判为形态正常,以此统计形态正常率。然后用透明质酸酶除去卵母细胞周围的卵丘细胞,用PBS液洗涤2次后于0.1%台盼蓝+PBS液滴中染色3min,用PBS液洗3次,镜检。活卵母细胞不着色,死卵母细胞充满蓝色颗粒,以此统计解冻后的细胞存活率。1.5统计方法实验数据用MicrosoftExcel软件进行分析,差异显著性检验采用t检验法。2结果与分析2.1解冻gv期卵母细胞形态检测由表1可见,采用程序化和玻璃化2种冷冻方法,解冻后GV期卵母细胞形态正常率和存活率均差异不显著(P>0.05)。但玻璃化冷冻的效果在一定程度上优于程序化冷冻。2.2冻保护液对gv期卵母细胞形态的影响由表2可见,采用DMSO和甘油作为冷冻保护液,解冻后GV期卵母细胞形态正常率差异不显著(P>0.05),但存活率前者极显著优于后者(P<0.01)。2.3玻璃冷冻对不同发育阶段小鼠卵的形态和存活率的影响由表3可见,解冻后GV期卵母细胞和MⅡ期卵母细胞形态正常率差异不显著(P>0.05),但存活率前者显著优于后者(P<0.05)。3讨论3.1玻璃化冷冻本研究采用的快速程序化冷冻能较好地克服卵母细胞脱水和细胞内冰晶形成之间的矛盾。其缺点在于操作过程中需要昂贵的程序化冷冻仪,不易推广应用。与程序化冷冻方法相比,玻璃化冷冻具有快速、经济的特点,而且不需要仪器和电源,可以在野外操作。但操作过程必须快速、熟练,否则玻璃化液会对卵母细胞产生巨大毒性和渗透性损伤。由表1可知,玻璃化冷冻的效果在一定程度上优于程序化冷冻。这主要由于程序化冷冻液在液相和固相间急速转换,各物质的膨胀率和收缩率不同易造成断裂面,表现为透明带或部分胞质破裂。而玻璃化冷冻只形成玻璃化样固体,能保持液态时的正常分子和离子分布,从而起到保护作用。但可能由于均用一套解冻液且用渗透性不强的甘油作为冷冻保护液,取得的结果均偏低且无显著差异。3.2不同时期小鼠卵母细胞的存活率和染色结果由表2可知,采用DMSO和甘油作为冷冻保护液,解冻后GV期卵母细胞形态正常率差异不显著(P>0.05)。原因可能在于均使用了作为细胞外液抗冻剂的高分子质量的蔗糖,其具有冷冻前脱水、调整细胞内外渗透压和解冻后使细胞内DMSO、甘油脱出的作用。所以很好地保证了渗透压的稳定,从而保证了形态的正常。但存活率前者极显著优于后者(P<0.01),这可能由于作为细胞内液抗冻剂的DMSO分子质量低、渗透性强,在冷冻解冻过程中膜受到的损伤小,表现为存活率高;而甘油由于膜渗透性低,会造成严重渗透性损伤,染色时台盼蓝从损伤处大量进入卵母细胞,从而使表现出来的存活率下降。3.3卵母细胞不同发育阶段的冷冻效果由表3可知,解冻后GV期卵母细胞和MⅡ期卵母细胞形态正常率差异不显著(P>0.05),这可能说明不同时期的小鼠卵母细胞膜通透性差异不是很大。但存活率前者显著优于后者(P<0.05),这可能表明了冷冻保存时,不同时期卵母细胞显微结构受到的影响是不一样的,GV期小鼠卵母细胞的细胞结构支