中药复方半夏和颗粒提取物抗五步蛇毒作用研究

中药复方半夏和颗粒提取物抗五步蛇毒作用研究

半夏是天南星科的一种半夏植物。半夏具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效;临床主要用于镇咳、祛痰、镇吐、抗溃疡、抗心律失常等作用。滴水珠具有解毒消肿、散淤止痛功效;临床用于治疗头痛、神经痛、胃病等疾病。半夏、滴水珠对毒蛇咬伤也具有防治作用,但其抗蛇毒作用目前缺乏系统的研究。本研究对半夏和滴水珠生药以及提取物的抗五步蛇毒中毒作用进行了初步的考察,现将研究结果报告如下。1材料和方法1.1材料表面1.1.1真空干燥箱及仪器(1)仪器。R201旋转式蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司),D180C自动双重纯水蒸馏器(上海申胜生物技术有限公司),AR2130电子精密天平(OhausCorp.PineBrook,NJ,USA),DZG-6050型真空干燥箱(上海森信实验仪器有限公司),SHZ-82恒温振荡器(常州国华电器有限公司),YS-100普通显微镜(NIKON)。(2)试剂。无水乙醇(AR,杭州长征化学试剂有限公司,批号:20110705),生理盐水(浙江莎普爱思药业股份有限公司,批号:H10424-1),纤维蛋白原(FIB)(上海太阳生物技术有限公司,批号:1320351),凝血酶时间(TT)测定试剂盒(凝固法)(上海太阳生物技术有限公司,批号:121080),活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒(鞣花酸)(上海太阳生物技术有限公司,批号:1121281),凝血酶原时间(PT)测定试剂盒(凝固法)(上海太阳生物技术有限公司,批号:103181)。1.1.2动物ICR小鼠72只,体重18～22g,雌雄各半,由浙江中医药大学实验动物中心提供。1.1.3蛇毒五步蛇为浙江中医药大学生物技术研究所提供;五步蛇毒由本实验室采集,采用低温冷冻干燥法进行提取干燥,呈白色。1.1.4保证了办学药学博士丁志山博士的鉴定工作季德胜蛇药片(南通精华制药股份有限公司,批号:110932),半夏和滴水珠(采自浙江省衢州市江山宝珠农业有限公司,经浙江中医药大学中药学博士丁志山教授鉴定,质量符合相关的规定)。药物的提取:将半夏和滴水珠药材分别打粉,过80目筛,分别取500g左右,加入2000ml95%乙醇回流提取1.5h,过滤,滤渣再次加入2000ml95%乙醇提取,共提取3次,合并3次滤液,减压蒸馏将乙醇蒸干,得半夏和滴水珠醇提物,经真空干燥24h后密封,阴暗条件下保存。乙醇提取物经碘化铋钾显色呈阳性,表明含生物碱类成分。1.2实验方法1.2.1给药剂量及给药方式将ICR小鼠随机分为半夏醇提物组、滴水珠醇提物组、半夏生药组、滴水珠生药组、模型组(五步蛇毒损伤组)、空白对照组以及阳性对照组,其中模型组大鼠为12只,其余组均为10只。半夏醇提物组、滴水珠醇提物组分别给予半夏和滴水珠95%乙醇浸膏2mg/只(各药物以生理盐水为溶剂,配成混悬液),空白对照组和模型组用相同剂量的生理盐水进行给药,阳性对照组给予季德胜蛇药片30mg/只,生药组给予对应的生药20mg/只(研钵中碾碎,用生理盐水配成混悬液)。各组小鼠均以0.2ml的药物灌胃,连续给药7天,每日给药1次。1.2.2大鼠中毒模型的建立各组小鼠均于末次给药后1h(除空白对照组外),于腹腔注射五步蛇毒100μg/只,造成小鼠五步蛇毒中毒模型。1.2.3大鼠体重变化的测量各组小鼠每次给药前以及处死前称取体重,比较各组小鼠的体重变化情况。若注射五步蛇毒后导致小鼠死亡,则于小鼠死亡后立即称取小鼠体重。1.2.4大鼠中毒的表现为造模后,由专人观察并记录各组小鼠的局部症状,以及食欲、呼吸、活动等全身状况,并在注射蛇毒12h后统计各组小鼠死亡率。1.2.5饮料的凝血酶活性测定小鼠造模后12h于眼眶取血1ml,加入0.1ml0.109mol/L枸橼酸钠抗凝管中,3000rpm×5min离心,取血浆,根据血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、凝血酶时间(TT)试剂盒说明书进行操作,测定相关指标。1.2.6红细胞计数wbc(1)红细胞(RBC)计数。小鼠造模后于眼眶取全血10μl,立即用990μl红细胞稀释液(NaCl0.5g,柠檬酸钠0.25g,甲醛溶液0.25ml,加蒸馏水溶解,定容到50ml)稀释成红细胞混悬液,取10μl,立即用490μl红细胞稀释液进行稀释后,在显微镜下用中方格计数的方法进行红细胞计数。(2)白细胞(WBC)计数。小鼠造模后,于眼底静脉丛取血10μl,用190μl白细胞稀释液(冰醋酸加水稀释成2%HAc溶液中,然后加入10g/L结晶紫3滴)稀释,在显微镜下用大方格计数的方法进行白细胞计数。(3)血小板(PLT)计数。小鼠造模后,于眼眶取全血10μl,立即用990μl血小板稀释液[10g/L草酸铵稀释液(乙二胺四乙酸二钠0.006g,草酸铵0.5g,用50ml蒸馏水溶解,混匀)]稀释成混悬液,取500μl,再用500μl血小板稀释液稀释后,于显微镜下用大方格计数的方法进行血小板计数。1.2.7肝胰腺、肝脏和脾指数测定小鼠末次给药20min后注射五步蛇毒,注五步蛇毒12h后处死小鼠,摘出胸腺、肝脏和脾脏称重,计算胸腺、肝脏和脾指数。计算公式:肝指数=肝脏重量/小鼠体重×100%;胸腺指数=胸腺重量/小鼠体重×100%;脾脏指数=脾脏重量/小鼠体重×100%。1.3统计学检验采用SPSS12.0统计软件进行统计学处理,计量资料以均数±标准差(ˉx±s)表示,行双侧检验,检验水准α=0.05。组间多重数据比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1小鼠体重和体重的变化各组小鼠灌胃给药7天后,统计每天体重。结果发现,在灌胃给药4天时各组小鼠体重都有一定幅度的增加,但各组间比较差异无统计学意义;在给药第5天开始,半夏生药组和滴水珠生药组的小鼠体重明显下降,与其他组相比具有统计学意义(P<0.05);半夏醇提物组及滴水珠醇提物组的小鼠体重与空白对照组和模型组比较均无统计学意义(均P>0.05)。见图1。2.2小鼠急性毒性反应的比较模型组部分小鼠在注射五步蛇毒10min后出现抽搐,活动减少;30min后模型组3只小鼠死亡,且除空白对照组外,其余组的小鼠也出现行动迟缓的现象,继而出现不饮水,呈嗜睡、呼吸急促等中毒症状,但半夏、滴水珠生药及醇提物组的小鼠在一定程度上可缓解中毒症状。2.3小鼠死亡率测定见表1。造模6h后,除空白对照组外,其余组小鼠均出现死亡。各组小鼠五步蛇毒造模中毒后12h,模型组12只小鼠中4只死亡,死亡率为33.33%;其余各组小鼠的死亡率与模型组比较,差异有统计学意义(均P<0.05);醇提物组的小鼠死亡率低于生药组,半夏的死亡率低于滴水珠,半夏醇提物与阳性对照组比较,无统计学意义。表明半夏的抗蛇毒作用优于滴水珠。2.4两组统计学比较见表2。半夏生药组和滴水珠生药组可引起小鼠脾脏指数和胸腺指数下降,但两组比较无统计学意义;两组各与其他组相比均有统计学意义(P<0.05)。比较各组小鼠的肝脏指数,除阳性对照组外,各组小鼠于注射五步蛇毒后均显著影响肝脏指数,与空白对照组相比具有统计学意义(P<0.01)。2.5各组小鼠小板计数的比较见表3。从表3可见,五步蛇毒造模后小鼠的红细胞、白细胞及血小板计数明显减少,与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。各药物组与模型组的小鼠比较,P<0.05;与阳性对照组比较,P<0.05。各生药组与提醇物组比较,P<0.05。2.6对凝血酶原时间、活化部分凝血酶时间和活见表4。从表4可见,五步蛇毒造模后小鼠血浆纤维蛋白原(FIB)含量上升,凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血酶时间(APTT)延长,与空白对照组相比,P<0.05;与各药物组比较,差异有显著统计学意义(均P<0.05);与阳性对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。各生药组与醇提物组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。3对样品含量和测定的影响在民间,半夏和滴水珠常用于五步蛇咬伤的治疗,常见的治法即直接吞服滴水珠或半夏生药,再配合一些清热解毒药物如紫花地丁等外敷。本实验研究结果发现,半夏和滴水珠生药对五步蛇毒中毒小鼠具有一定的疗效,与蛇毒损伤模型组相比,半夏和滴水珠能显著影响五步蛇中毒小鼠血液中PT、TT、APTT和FIB,同时,对五步蛇毒中毒小鼠血液中血小板计数、红细胞计数和白细胞计数也有一定的影响,与模型组相比具有统计学差异,但效果不如季德胜蛇药的阳性对照组。此外,半夏和滴水珠生药虽然有一定的疗效,但可影响小鼠的正常生长(体重比空白对照组和醇提物组轻),故在使用时必须严格注意用量,并加强监管。但通过乙醇提取可有效降低半夏和滴水珠的毒性,与生药组相比脾脏指数、体重变化率等均具有显著统计学意义,并且可提高疗效(与生药组相比有显著性差异)。有文献报道,被五步蛇咬伤,局部伤口(牙痕)处立即注射50%～75%的酒精可收到一定的解毒效果。本研究结果显示,乙醇提取可以提高中药半夏和滴水珠的抗五步蛇毒中毒作用。季德胜蛇药片是目前常用的治疗毒蛇咬伤的中成药。我们观察发现,季德胜蛇药抗蛇毒的效果优于半夏、滴水珠等单味药,且未出现毒副作用,但季德胜蛇