差速离心对j亚群禽白血病分离株scau11-h生物学活性的影响

差速离心对j亚群禽白血病分离株scau11-h生物学活性的影响

关于鸟类疾病的形态，已经进行了关于感染鸟类疾病的超微细胞成像的研究，以及对不同组织分布的如腔袋、肾和脾的超微细胞的研究。结果表明，完整的革兰氏病变球形，整个病毒直径为80120nm，平均约90nm。禽肿瘤病毒在高温下很快灭活,在37℃下的半衰期从100min到540min不等(平均大约260min);在-15℃条件下,半衰期低于1周。病毒感染力的热不稳定性成为病毒保存中的关键因素,温度也成为实验操作中保证病毒生物学活性的重要考虑因素。禽白血病病毒在细胞上培养周期长,一般需7~9d,普通传代细胞培养上清所含病毒滴度大约105TCID50,在实验室通过传统接毒盲传提高病毒滴度耗费时间长,也极易造成不同亚群间的交叉污染。超速离心可以使病毒样本浓缩100倍甚至更高,浓缩后的病毒是否具有生物学活性成为影响后续试验研究的关键因素。为此,本研究通过实时荧光定量RT-PCR、IFA和ELISA等方法验证差速离心后浓缩病毒的生物学活性。1材料和方法1.1创创期实验单位J亚群禽白血病分离株SCAU11-H,由农业部兽用疫苗创制重点实验室提供(GenBank登录号:KC149972.1)。DF-1细胞来源于美国ATCC,ALV-Jgp85单抗JE9由扬州大学兽医学院秦爱建教授惠赠。1.2细胞培养及遗传稳定性检测DF-1细胞和CEF细胞培养成单层后接种SCAU11-H,37℃、5%CO2条件下培养7d后,用ALV抗原ELISA检测试剂盒(IDEXX)检测细胞培养上清,阳性样品测定TCID50后保存于-70℃作为连续传代的接种物。1.3冻融法培养抗菌液待CEF细胞在175cm2培养瓶(NEST)生长至对数生长期时接种SCAU11-H病毒,每瓶用1%FBS(Gibico)维持液20mL培养9d后反复冻融3次,5000r/min(4℃)条件下低速离心20min。再取上清于16000g/min(4℃)条件下用超速离心机(Optima)高速离心60min沉淀病毒粒子。去除上清后用400μLDMEM重悬浓缩病毒,分装后取部分送往广东省微生物研究所做透射电镜观察,其余存放在-70℃备检。1.4病毒生物学活性的激活1.4.1病毒接种与检测将浓缩后的病毒用DMEM作连续10倍稀释(10-5-10-11),接种已长满单层CEF细胞的96孔培养板,同时设正常CEF不接种病毒的对照,培养3d后通过IFA检测测定病毒滴度。判定结果用Reed-Muenchcalculator(1938)软件计算病毒的细胞半数感染剂量。1.4.2扩增目的产物根据已发表的SCAU11-H基因序列,设计检测env基因的引物,上游引物5′-AATATTGAATGCGAT-GCTGGAAGAC-3′和下游引物5′-CTATGGGAT-CATCTTCTACCTGTAT-3′,扩增目的产物为221bp;根据已发表的鸡内参GAPDH(GenBank登录号:NM_204305)基因序列设计引物,扩增目的产物为112bp,上游引物5′-GAACATCATCCCAGCGTCCA-3′和下游引物5′-CGGCAGGTCAGGTCAACAAC-3′。将浓缩后的SCAU11-H以105TCID50/0.2mL的感染剂量接种DF-1细胞,用试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)抽提细胞总RNA后反转录成cDNA。目的基因和内参基因扩增产物分别克隆进pMD18-T载体后送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序显示序列正确。荧光定量RT-PCR检测结果通过2-△△Ct方法进行分析。1.4.3alv-jgp65单克隆抗体的制备CEF细胞消化至细胞培养板中,按照105TCID50/0.2mL剂量接种浓缩后的病毒SCAU11-H,培养3d后弃上清,预冷PBS洗涤后用4%多聚甲醛固定15min,4℃湿盒过夜孵育1∶200稀释的抗ALV-Jgp85单克隆抗体。用PBST洗涤3次,加入1∶200稀释的FITC-羊抗鼠IgG,37℃孵育1h,PBST洗涤后再用DAPI(碧云天)室温染色15min,用PBST洗涤两次后在荧光显微镜(Leica)下观察。2结果2.1电子致密的囊膜图1显示,病毒粒子直径为60~140nm,由外部的囊膜和内部的电子致密的核心构成,多近似球形,也有一些类似长杆形、鼓锤形的形态。2.2病毒生物学活性的测定2.2.1病毒滴度的变化表1显示,浓缩前后SCAU11-H病毒的滴度(TCID50/mL)由原来的1.58×105/mL上升到8.89×1011/mL,说明浓缩后病毒滴度极大提高了。2.2.3细胞表面及胞浆的绿色荧光见中插彩版图3显示,感染组(左)呈阳性反应,细胞表面及胞浆均有明显的绿色荧光(如红色箭头所示);对照组(右)为阴性,只有细胞核经DAPI核染呈蓝色,而细胞表面及胞浆没有绿色荧光。3病毒的形态结构及生物学活性本实验室分离的血管瘤相关J亚群禽白血病分离株SCAU11-H是2011-2012年在广东省商品肉种鸡上分得。在细胞上传代后ELISA检测群特异性抗原p27为阳性,用各种特异性检测引物进行PCR扩增,仅检测到545bpJ亚群特异性条带,而没有扩增到其他的如ALV-A,ALV-B,MDV,REV等条带。与细胞或组织超微切片方法相比较,差速离心浓缩后的病毒在电镜下的形态更为清晰直观。透射电镜下SCAU11-H病毒粒子直径为60~140nm,多近似球形,也有一些外层部分呈长杆形、鼓锤形的形态结构。Fujita等研究指出,白血病/肉瘤病病毒(ALSV)粒子经负染呈球形,在干燥条件易扭曲成精子状、弦月状或其他形状,而其内部类核体与外层部分相比似乎不易变形。另外,也有报道指出,病毒的异常形态结构可能是病毒增殖过程中的某一特殊方式。对于本次试验观察到一些病毒异常形态结构,笔者认为可能是由于差速离心、外界温度湿度影响或是磷酸钨负染等其他原因导致的形态变化。Kolokoltsov和Reddy等分别通过超速离心浓缩经人工改造拯救后的病毒,然后将得到的较高滴度的浓缩病毒粒子进行稀释后用于下一步试验。特别是针对一些低复制能力病毒的人工发病模型的试验,病毒感染滴度将是反映其致病性的重要影响因素。本试验通过差速离心法浓缩J亚群禽白血病分离株SCAU11-H后,发现浓缩前后病毒的滴度(TCID50/mL)可由原来的1.58×105/mL上升到8.89×1011/mL。从这些研究中,可以发现对于一些人工改造如嵌合型、缺失、突变等低复制能力病毒,或者是在细胞上繁毒周期长的慢病毒,超离浓缩将是快速提高病毒滴度的一种方法。本试验针对ALV-J分离株SCAU11-H的env基因和鸡的GAPDH的基因保守序列分别设计引物进行扩增,检测病毒不同时间点的浓缩后病毒RNA合成水平。RT-PCR结果表明,1d、3d、5d病毒RNA合成水平逐渐增加,说明浓缩后的病毒在DF-1细胞上能正常复制。间接免疫荧光、ELI-SA检测结果阳性,表明病毒蛋白gp85、p27正常表达,进一步说明了病毒生物学活性正常。由于J亚群禽白血病病毒对温度敏感,超速离心所有的试验步骤都尽量在冰上操作以避免影响其生物学活性。但因试验操作时间和4℃离心时间均较长,确实有必要鉴定浓缩后病毒的生物学活性。ELISA、q-PCR、IFA检测结果表明,差速离心并