五子衍宗方对环磷酰胺致小鼠dna损伤的影响

五子衍宗方对环磷酰胺致小鼠dna损伤的影响

环磷酰胺（ctx）是目前临床上常用的烷基吡啶抗剂。它也是一种免疫抑制剂。它通常用于治疗血液、肿瘤、伤口和乳腺癌等多种肿瘤。然而,CTX在抑制肿瘤细胞增殖的同时,对正常细胞具有细胞毒性,CTX代谢产物能够和大分子如蛋白质、RNA、DNA结合,导致DNA损伤,从而引起骨髓抑制、生殖毒性等不良反应。CTX的临床疗效也因此而被限制,故减少CTX在临床应用中的不良反应非常重要。本实验观察五子衍宗方对CTX致小鼠DNA损伤的影响,探讨其作用机制。1实验材料1.1实验动物及许可证40只8~9周龄SPF级BalB/c种小鼠,体质量22~25g,湖北省实验动物中心提供,动物许可证号:SCXK(鄂)2008-0005。分笼饲养,湿度55%~65%,环境温度(20±2)℃,12h光照,啮齿类动物饲料喂养,自由饮水。1.2药材、饮料的制备五子衍宗方由枸杞子、菟丝子、覆盆子、车前子、五味子组成,原药材经三峡大学汪均植教授鉴定为正品。按照传统方法煎取,浓缩至粉末,提取率为18.8%,临用前配成相应浓度的溶液。CTX购自江苏恒瑞医药股份有限公司,批号13030425。1.3其他甲基氨基甲烷正常熔点琼脂糖(NMA),低熔点琼脂糖(LMA),肌氨酸钠,TritionX-100,溴化乙锭(EB),二甲亚砜(DMSO),三羟甲基氨基甲烷(Tris-base),乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2)。稳流可调式电泳仪(北京六一仪器厂),BX51型Olympus荧光显微镜(日本)。2实验方法2.1衍宗方高剂量组将小鼠随机分为正常组、模型组、五子衍宗方低(100mg/kg)剂量组、五子衍宗方高(200mg/kg)剂量组,每组8只。五子衍宗方低、高剂量组预给药1周后,除正常组外,其余各组腹腔注射CTX100mg/kg造模,隔日1次,共3次,同时五子衍宗方低、高剂量组小鼠按照0.1mL/kg继续给药。2.2指标检测2.2.1elisa检测末次给予CTX后12h处死小鼠,眼球取血后静置30min,3500r/min离心10min,分离血清,ELISA测定血清中8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的含量。2.2.2荧光显微镜观察取出股骨,用PBS冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞,过滤,用PBS洗涤2次后,悬浮于PBS中,用细胞计数板计数,将细胞悬液调整至细胞密度为1×106个/mL。在普通载玻片上用玻璃胶粘上小玻璃条,用PBS配制1%的正常熔点琼脂糖,煮沸后取100μL均匀铺在载玻片上,置于4℃,固化5min即第1层胶,取100μL于37℃水浴中保温的0.5%的低熔点琼脂糖,与100μL骨髓细胞悬液充分混匀后加入第1层胶上,置于4℃,固化5min即第2层胶。将载玻片浸入新鲜配制的4℃的碱性裂解液,4℃冰箱内避光裂解2h。将载玻片从裂解液中取出,用蒸馏水轻轻冲去多余的盐分,将凝胶载玻片放入电泳槽中,加入4℃冰箱预冷的电泳液至盖过胶面2~3cm,避光静置4℃解旋20min。调节电泳仪至电压25V、电流300mA,4℃避光电泳20min。电泳结束后,将凝胶载玻片从电泳槽中取出,浸入pH7.0Tris-HCl中和液中,每5min换液1次,中和20min。在凝胶上滴加溴化乙锭(10μg/L)100μL,2min后用蒸馏水洗涤2次,稍微晾干,尽快在荧光显微镜下进行观察。将染色好的载玻片放在荧光显微镜的40倍镜下观察拍照,采用Casp1.2.3彗星分析软件对彗星图像进行分析。选取彗星图像的Olive尾矩、尾距、尾长和尾部DNA含量进行分析。3组患者均数差异比较采用SPSS13.0统计软件进行分析。实验数据均以ue0af±s表示,多组间差异比较采用方差分析,以Dunnet-t检验比较2组间均数的差异。P<0.05表示差异有统计学意义。4结果4.1子衍宗方对ctx引起的8-ohdg含量的影响与正常组比较,模型组8-OHdG含量明显增加;与模型组比较,五子衍宗方低、高剂量组能显著降低CTX引起的8-OHdG含量增加。结果见表1。4.2小鼠骨髓细胞微核试验结果与正常组比较,模型组小鼠骨髓细胞彗星电泳图像的尾部DNA含量、Olive尾矩、尾距、尾长均明显增加。五子衍宗方低、高剂量组都能明显降低小鼠骨髓细胞的彗星图像的尾部DNA含量、尾距、尾长。结果见表2、图1。5抗ctx损伤的机制探讨CTX是临床常用的的广谱抗肿肿瘤药物和免免疫抑制剂剂。CTX在体体外无活性,进入体内后后可以通过肝脏细胞色色素p-450BB和p-450CC单加氧酶酶催化,经过一系列变化化生成磷酰胺胺氮芥和丙丙烯醛。磷酰酰胺氮芥能与细胞内的的大分子如蛋蛋白质、DNAA、RNA发生生烷化作用,形成DNA链链内和链间的交叉联结结,从而干扰扰体内细胞的分裂增殖。另一方方面,CTX代谢过程中会会产生大量活性氧自由由基,自由基基中有极为活活泼的单电电子,与亲核核性的DNA结结合,产生DDNA-DNA或DDNA-蛋白质质的交联,还还会与DNA碱碱基和脱氧核糖发生化化学变化,引引起脱氧核糖分解、磷磷酸二脂键断断裂、碱基基降解、氢键键破坏、引起单双链的的断裂。机体DNA一旦旦发生损伤伤,会通过阻滞细胞周期期修复受损的DNA,不能能修复的DDNA则走向程序性死亡亡,从而有效效识别和清除除DNA损伤伤。DNA损伤如果没有即即时得到修复,损伤的积累将会导导致机体神经退行性病病变、衰老等等疾病的发发生,严重威威胁人类的健健康。单细胞凝凝胶电泳技技术是目前广广泛应用的的检测DNA损损伤技术,可可用于各种种细胞及组组织的单细胞胞水平的DNNA链断裂的的研究。当外外界因素造造成DNA损伤伤时,细胞膜和核膜膜在裂解液的作用下被被去除,蛋白白质、RNA及其他成分在在高盐溶液的作用下扩扩散到裂解液中,只有核DNA由于于分子量太太大留在原位位。在碱性性电泳液中电泳,DNA未未损伤则无无拖尾现象,经荧光染色色后呈圆形;若细胞DDNA损伤,DDNA双链解旋旋变成单链链,损伤的DNA的单链及及其碎片会会向阳极迁移移,形成拖尾尾,经荧光染色后形成成形似彗星的图像。DNAA损伤越严严重,产生的片段越小,碎片越多,彗星尾部越越长,亮度越越亮。通过定量分析可可判断DNA是是否损伤及及损伤程度。本实实验结果表表明,当给予予CTX后,小鼠血清中8-OHdG含含量显著增增加,五子衍衍宗方组能显显著降低模型小鼠8-OOHdG含量,表表明五子衍衍宗方能够减减轻CTX引起的小鼠DDNA的氧化损损伤。同时时我们通过单单细胞凝胶电泳实验发发现,与正常常组比较,模模型组DNA含含量、尾距距、尾长几个个指标均显显著增加,而而五子衍宗宗方各组都对DNA有保保护作用,表表明五子衍宗方能够显显著保护骨髓细胞的DDNA免受CTTX损伤。综上上所述,五子子衍宗方能够够抑制CTXX引起的DNA损伤,促进损伤的DDNA修复。其机制可能能与五子衍宗方提高机机体的抗氧化化能力、清清除CTX代谢谢过程中产生的自由基基及增强损伤伤DNA修复复的能力有关关。的氧88配8-OHd