重楼愈伤组织诱导培养研究

重楼愈伤组织诱导培养研究

巴黎植物属于白合科，是一种多年生草本植物。作为该属植物的分布中心之一，有17种和10种变体。本种植物不仅具有清热解毒、消肿胀、止痛、净化肝脏、镇静等功效，还具有止血、肿瘤、抗高血压、抗凝剂和心血管等生理活性。因此，对这一自然资源的全面开发和利用具有重要意义。然而，随着近年来重建筑物资源的需求逐年增加，且主要领域的开采和挖掘忽视了重建筑物的保护和繁殖，野生物种资源严重受损，供需矛盾突出。因此，对重建筑物的细胞培养进行了研究，解决了资源保护和开发之间的矛盾。用细胞培养生产药用成分的工业化研究始于20世纪50年代,已有许多成功的先例.但尚未见到重楼细胞培养的有关报导.1材料和方法1.1植株培养和管理重楼取自四川峨眉山海拔2450m的山上,整株植株带土挖取,置于自封袋内带回实验室.接种前置于18℃弱光下保存,一般滞留2～4d即接种培养.取材分萌芽期、展叶期、花冠露白期和倒苗期.1.2愈伤组织诱导培养试验采用MS(Murashige和Skoog)培养基为基本培养基,附加不同浓度和种类的生长调节物质.根据使用的生长调节剂种类和浓度,共设置15个处理用于愈伤组织诱导培养,见表1.1.3芽、叶的活化植株清洗干净后,除幼嫩叶片外,其余材料均在流水中冲洗2h以上.然后对材料分别进行消毒灭菌,先用70%的酒精浸泡30s,然后分别用/的升汞灭菌数分钟.一般幼嫩的芽和叶片灭菌3～4min;根茎灭菌10min,子房和根灭菌6～8min.灭菌以后的材料用无菌水清洗3～5次,最后分别接种于不同处理的培养基上,置于20℃温度条件下培养.2结果与分析2.1附加naa和b、h的组合对愈伤组织的诱导效果试验设置的15个处理所诱导形成的愈伤组织数和小球茎数的结果见表2.结果显示,15个处理中,以M(MS+BA1.0mg/L+KT1.0mg/L+2,4-D1.0mg/L+IAA1.0mg/L)诱导愈伤的效果最好,诱导频率最高,达28.89%(图1).其次为B(MS+BA1.0mg/L+IAA2.0mg/L)和H(MS+BA2.0mg/L+IAA1.0mg/L),诱导频率分别为26.7%和21.95%.同时,在B和H的处理中,从幼芽基部还能诱导出几个小球茎(图2).从分析附加的生长调节物质可看出,加NAA的处理中,愈伤组织形成均少,且没有球茎的形成.虽然M组合诱导愈伤的频率最高,但B和H的组合不但可以诱导愈伤而且可以诱导球茎的形成,这个结果与同科不同属植物延龄草的组织培养研究中所得的结论是一致的,且其使用浓度以1.0mg/LBA和2.0mg/LIAA为最佳组合.2.2种外植体诱导频率试验采用根、根茎、子房、幼芽和叶片5种器官为外植体,分别接种于15种处理的培养基上,试验结果见表3.由表3可看出,根和叶片既不能诱导出愈伤,也不能诱导出小球茎,接种后很少启动,污染也较少,大约2个月后干枯死亡.而根茎、子房、幼芽都能不同程度地诱导出愈伤组织,特别是幼芽,不但诱导出的愈伤组织块数最多诱导频率最高达且还能诱导出小球茎.可见,不同的外植体的诱导频率差异很大.2.3不同发育阶段的常用植物中愈伤组织的诱导频率试验中作为外植体的根和根茎取自4个时期,即萌芽期、展叶期、花冠露白期和倒苗期.子房取自花冠露白期,叶片取自萌芽和展叶期,幼芽取自萌芽期、展叶期、倒苗期.不同发育阶段的根茎对诱导频率具有显著的影响,结果列于表4.从表4的结果可看出,以展叶时旺盛生长的根茎作外植体,其愈伤组织的诱导频率最高,达16.6%.萌芽期取材次之.在花冠露白期和倒苗期,根茎则很难诱导产生愈伤组织.在四川峨眉山海拔2000m左右的环境下,重楼属植物的生长期一般为4月至5月中下旬,大约二个月左右的时间.因此,取材时间应在4月至5月上旬这段时间.但在这段时间取材培养,会发现外植体极易污染.必须采取一些措施减轻或控制外植体的污染.2.4愈伤组织的增殖试验中发现,不同来源愈伤组织的保持能力差异较大.在M培养基上形成的愈伤组织增殖较快,但极易褐变,寿命较短.B、H培养基上形成的愈伤组织增殖较慢,但愈伤组织的质地较坚硬,呈淡黄色,展示较好的保持潜力.从外植体来看,幼芽基部形成的愈伤组织增殖较快,愈伤组织呈颗粒状,较易分散.根茎形成的愈伤组织质地较疏松,时间长了以后,愈伤组织易纤维化,失去增殖能力.子房形成的愈伤组织也较疏松,且易褐变3重楼协同培养的可行性以上试验基本上找到了诱导重楼产生愈伤组织的最佳外植体取材时间及培养条件,即4月至5月上旬获取的幼芽外植体在BA和IAA的组合条件下,既能诱导愈伤组织的形成,又能诱导小球茎的产生,且产生的愈伤组织质地适中,呈颗粒状,具有较好的分散能力.本试验条件下,取材培养的最佳时间为萌动期到旺盛生长期,因这段时间内组织形成层活动活跃,细胞分裂较旺盛,材料易启动.而开花期和倒苗期,植物组织进入休眠状态,细胞活动减弱,材料的反应很慢,不易诱导出愈伤组织.因此,取材时期在某种程