白无菌组培技术研究进展

白无菌组培技术研究进展

白牙[f.]是蓝科白牙属的一种多年生草本植物。白牙干燥的叶子。姜和紫兰也被称为好姜和白牙。李清照把它称为“白牙”。他的根是白色的，所以叫它白牙。白芨喜阴耐潮,多生于石壁、苔藓层中,原产于中国,广布于长江流域各省,全国各地有少量栽培,朝鲜和日本也有分布。其花色艳丽、多彩,在叶片的衬托下,格外端庄而优雅,非常适用于花坛布置和和室内盆栽。此外,白芨块茎含黏液质和淀粉等,可作糊料,也可入药,其味苦、甘、涩,性微寒;归肺、肝、胃经,具有收敛止血,消肿生肌的功能,在临床上使用较多。白芨巨大的生物价值,使其在市场上供不应求。然而,白芨的种子微小,无胚乳提供发芽所需养分,在自然状态下极少萌发成苗。加之人们为了追求利益,对野生苗进行大量挖掘,导致白芨数量急剧减少,资源匮乏,随着环境条件的恶化,野生白芨的分布范围也日益缩小。因此,快速繁殖白芨幼苗以挽救白芨资源已迫在眉睫。而传统的人工栽培通常采用分株繁殖,其繁殖效率较低,周期长,不适宜用于商业化的规模种植,无法满足市场需求。所以具有繁殖速度快,周期短,可人工控制培养条件,管理方便等优点的植物组织培养技术是白芨快速繁殖方法的重要选择。鉴于此,本文从白芨组培外植体的选择、消毒方法、培养基、激素的选择以及炼苗移栽等方面综述了白芨无菌组织培养技术的研究进展,以期为白芨的产业化栽培提供理论参考。1白种子外植体白芨种子虽无胚乳,但种子的一端微钝,具种孔。凃美智和Arditti等研究认为种孔有利于各种营养物质的进入,进而有助于萌发。种子饱满的种胚积累的丰富营养,也可能对种子萌发起到了重要作用。因此种子在适宜的培养基上萌发率高,速度快,且白芨的蒴果消毒操作简单方便,不易污染。因而大多数学者在快繁中首选白芨种子作为外植体进行研究,叶静等在白芨的快速繁殖体系建立中采用种子进行无菌播种,并成功获得无菌苗。喻苏琴等利用白芨种子进行无菌播种,研究了培养条件对白芨种子萌发的效应。除了采用种子播种外,根据细胞全能性原理,白芨的任何一部分都可以作为外植体。石云平等在正交实验研究不同外植体白芨愈伤组织形成的影响中发现,与根,叶相比,假鳞茎更加适合用于愈伤组织诱导,其诱导率达为83.3%。另外,很多学者对新鲜块茎的顶芽、茎尖、侧芽、块茎花茎、地下茎及幼根等部位都做了相应的研究,均成功地繁殖出白芨无菌苗,建立了白芨的快速繁殖体系。2种子消毒和消毒外植体的消毒是组织培养研究的第一步,选择正确的消毒剂和把握消毒时间是关键。白芨蒴果的消毒简单,易操作。将采收的白芨蒴果,切除花梗和残留柱头、花瓣,用70%酒精擦拭干净后浸入1g/LHgCl2溶液中20min,在超净工作台上以无菌水清洗3~4次,也可以将其蒴果用流水洗净后,再用75%酒精表面消毒1min,然后在10%的次氯酸钠溶液中消毒10min,无菌水冲洗4~6次,期间需要不停的摇动,使其消毒彻底。最后在无菌条件下,纵向剖开蒴果,将种子置于灭菌的滤纸上吸干水分后,取出种子接种于培养基上。对于后者使用的灭菌试剂溶液,喻苏琴等认为,次氯酸钠溶液的最佳浓度为1%,浓度过高对种子有损害,且形成真叶的速度更缓慢。对于根、茎等外植体而言,其消毒处理和蒴果的处理方式几乎是相同的,只是时间有所差异。3培养基的种类和浓度对植株生长的影响培养基是植物体离体培养的基本营养来源,选择合适的基本培养基有利于外植体的发育和生长,基本培养基的种类、植物激素及其浓度的配比是植株能否在该培养基中正常生长的关键。白芨快繁体系建立中常用的基本培养基有花宝1号、KC、1/2MS、MS和ZW,不同的培养阶段激素的浓度和配比不同。3.1不同浓度的生物固氮培养基种子的萌发是决定以种子为材料的培养是否能成功的关键。大量的研究表明种子MS、1/2MS、KC、花宝一号和花宝二号这几种培养基上均能正常萌发,但大多数研究者在研究时一般会选用MS、1/2MS、KC作为基本培养基,其中MS为白芨种子萌发中最常用的培养基,在此基本培养基上萌发的种子不仅萌发速度快、生长正常,萌发率也很高,赵曼丽等使用MS+1.0~3.0mg/LBA+1.0mg/LNAA+3g/L碳粉播种,种子萌发率高达99.7%,并发现NAA的用量稍微高于BA利于种子萌发。田英翠在以幼根作为外植体培养时是选用的ZW培养基,通过正交实验得到ZW+1.0mg/L6-BA+2.0mg/LNAA+10%椰子汁+2g/LCH为幼根诱导原球茎的最适配方,同时发现激素6-BA和NAA对增殖和诱导培养具有促进作用,其中6-BA更为显著,ZT、KT作用不明显。石云平等人研究得到MS+1.0mg/L6-BA+2.0mg/L2,4-D是白芨假鳞茎诱导愈伤组织诱导的最佳培养基,适宜浓度的6-BA和2,4-D有利于愈伤组织的形成。除激素差异以外,其混用时的浓度及比例也是很重要的因素。余朝秀采用培养基组合MS+6-BA1.0~3.0mg/L+NAA0.2mg/L成功的诱导出茎尖及侧芽萌生增殖芽。3.2培养基的选择白芨初代培养得到的原球茎,可通过增殖后进行芽的分化,再对丛生芽进行增殖培养,也可以直接进行丛芽的诱导增殖培养来获得大量幼苗。张燕使用培养基1/2MS+6-0.2mg/LBA+1.0mg/LNAA培养原球茎,研究表明白芨原球茎的增殖与丛生芽诱导在大多数培养基中是并存的。此外,原球茎在MS+1.0mg/L6-BA+0.15mg/LNAA、MS+1.0mg/L6-BA+0.15mg/LNAA及MS+1.0~2.0mg/LBA+2.0mg/LKT+0.5mg/LNAA+4.0g/L琼脂+15g/L魔芋粉的增殖效果也较好。对于根、茎等外植体的继代培养,石云平等认为,白芨愈伤组织的最佳增殖培养基为MS+6-BA1.0mg/L+3.0mg/L2,4-D,芽分化最佳培养基为MS+1.0mg/L6-BA+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LTDZ。田翠英等在研究中发现培养基ZW+0.5mg/LNAA+1.0mg/L6-BA对原球茎的增殖和分化效果都非常好。房慧勇认为直接诱导无菌苗增殖的最适宜组合为Fast+TDZ5.0mg/L+0.05mg/LNAA+50mg/L肌醇,增殖倍数高达7.3倍。与大多数兰科植物相同,培养基中激素的种类及浓度配比对白芨原球茎诱导及芽分化方向起着决定性的作用,邹娜研究发现2,4-D会抑制原球茎的诱导和分化,这与朱玉秋的研究是相似的,而等浓度的NAA与KT或6-BA的配合使用对白芨原球茎的诱导效果很好。另有研究认为肌醇和TDZ也能在继代培养中发挥重要作用。3.3白无根幼苗的生根和壮苗白芨的生根培养基中1/2MS、MS培养基最为常见,附加一定浓度的NAA和6-BA,或单用NAA都可以有效地诱导白芨生根。在生根培养中,适量的GA3有利于根的生长和壮苗。田翠英还认为番茄汁对白芨无根苗的生根和壮苗也有明显的促进作用,将白芨无根幼苗接种到1/2MS+1.0mg/LNAA+1.0mg/LGA+200g/L番茄汁培养基中,植株长势健壮,根系发达,有利于移栽炼苗。袁宁研究发现,在生根培养基中加入香蕉泥能有效地促进根的诱导,而蛋白胨则对生根有一定的抑制作用。4白的人工栽培综上所述,前人对白芨的组织培养研究已较为成熟,为白芨的快速繁殖提供了技术保障。但是目前关于白芨的研究都是较为单一的,并且从商业角度出发的有关白芨人工栽培的研究较少。此外,虽然组织培养解决了白芨种苗来源的问题,但幼苗移栽后到成药采收需要的时间较久,投资较大,白芨的工厂化发展仍然在很大程度上受到了限制。因此,在不影响白芨的药用功效的前提下,如何加快白芨的生长速度,缩短采收时间,还需进一步研究。通过植物细胞培养技术大量生产白芨的药用成分也是今后工业化生产的努力方向。只有联系实际生产,考虑产出率、成本、收益等因素对白芨的栽种进行综合性的研究,才能早日实现工厂化育苗。3.4基质选择与栽植