铁皮石斛的组培快繁研究

铁皮石斛的组培快繁研究

0铁石斛在山区的繁殖与复育科贝夫是多年生草本植物。铁皮石斛是传统名贵中药材,主要分布在秦岭、淮河以南的皖、浙、云、贵、川等地的山区,生于海拔1600m的山地半阴湿的岩石上。铁皮石斛蒴果成熟时易开裂,且种子粒径小,自然繁殖率低。由于铁皮石斛的生长条件的特殊性和分布的局限性以及多年的人为过度采挖破坏,自然资源濒临枯竭。因此,为了保护和有效利用铁皮石斛,采用组织培养技术,大量快速繁殖铁皮石斛组培苗显得尤为重要。以铁皮石斛离体器官诱导原球茎,再通过原球茎的增殖、分化培养而得到大量幼苗,这种快繁方法可加快铁皮石斛繁殖速度,推进工厂化育苗。笔者以铁皮石斛嫩茎为外植体进行铁皮石斛原球茎诱导与增殖的研究。1材料和方法1.1试验材料供试铁皮石斛的嫩茎采于海南省万宁市兴隆热带植物园。1.2成球茎的诱导以幼嫩茎段为外植体,经过外植体消毒处理,接种到原球茎诱导培养基上,经过一段时间的诱导,外植体膨大并产生原球茎,将诱导形成的原球茎转移到增殖培养基中培养。基本培养基:MS+7.5g/L琼脂+30g/L蔗糖,pH5.8。培养条件:温度(25±1)℃,光强为2000lx,光照时间12h/天。数据采用SPSS12.0软件进行统计分析。1.2.1植物消毒1.2.2茎诱导1.2.3原茎繁殖2结果与分析2.1不同消毒方法对茎段成活率活率的影响外植体的消毒是组织培养的关键,对于原球茎诱导能否成功有非常重要的作用。采用3种不同消毒剂对外植体进行不同时间的消毒处理。由表1可知,铁皮石斛茎段对消毒剂很敏感,不同的消毒方法茎段成活率活率差异较大;0.1%HgCl2+2%NaClO与0.1%HgCl2+10%H2O2的处理效果不好,外植体平均污染率高(分别为56.25%,40.25%)、平均成活率低(分别为3.25%,3.5%),0.1%HgCl2处理的效果较好,其平均污染率低(37%),平均成活率高(7.75%),0.1%HgCl2消毒8min的成活率最高(19%)。分析认为,0.1%HgCl2处理时间为8min对铁皮石斛嫩茎消毒的效果最好,污染率低(10%)、成活率高(19%)。2.2不同浓度6-ba和naa对原球茎激素表达的影响由试验结果(表2)可知:不同处理对原球茎的诱导影响有显著差异,6-BA+NAA激素组合的平均原球茎诱导率高于其它激素组合(48.05%),同时,6-BA+2,4-D组合的原球茎诱导时间都比较短(19天)。综合考虑,选择6-BA,NAA与2,4-D作为原球茎诱导的激素。确定诱导原球茎激素浓度的正交试验结果见表3,不同浓度6-BA与NAA对原球茎的诱导率影响有显著差异,并且呈负相关(分别为r=-0.716,r=-0.473),6-BA与NAA浓度越高原球茎的诱导率就越低。不同浓度2,4-D对原球茎的诱导率影响差异不显著(P=0.312),但是低浓度的NAA诱导原球茎的时间比较长,高浓度的NAA处理诱导原球茎较松散,同时会出现玻璃化现象。因此原球茎诱导的最佳培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+2,4-D1.0mg/L,原球茎诱导率可达86.67%。2.3激素4-ba和naa对铁皮石斛原球茎增殖系数的影响6-BA对原球茎增殖系数影响显著差异(P=0.002),6-BA浓度与原球茎的增殖系数呈正相关(r=0.918),随着6-BA浓度的升高,增殖系数增大(图1),不同浓度NAA对增殖率影响差异不显著(P=0.8),但NAA浓度过高会使无菌苗出现玻璃化现象,不利于原球茎的增殖。激素6-BA3.0mg/L与NAA0.3mg/L组合对铁皮石斛原球茎增殖的效果较好,增殖系数高,分化苗生长正常(图2)。所以确定原球茎增殖培养基为MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L。3最佳原球茎增殖培养的筛选目前,铁皮石斛组织培养中采用的外植体有种子、茎段、叶、根尖等。铁皮石解以种子作为外植体进行培养的研究较多,但是关于铁皮石斛原球茎诱导的研究主要是通过茎尖、茎段、幼叶、种子等作为外植体→不定芽→原球茎的诱导方式。但以铁皮石解茎段作外植体直接诱导原球茎的研究不多。以铁皮石斛嫩茎为外植体,70%的酒精进行表面消毒3s,再用0.1%HgCl2浸泡8min,接种到原球茎诱培养基MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+2,4-D1.0mg/L中,接种15~20天后萌动,茎段膨大,切面及顶部形成疏松组织,继续培养后膨大的组织表面形成凸凹不平的颗粒物。随着培养时间的延长,颗粒物会形成类原球茎颗粒物,再将其转入到增殖培养基中,原球茎增殖的同时也可以分化出芽点。原球茎诱导时间为30天左右,诱导出原球茎后要适时转入增殖培养基中,如果培养时间过长就会产生玻璃化现象。激素的种类与浓度对铁皮石斛原球茎的诱导是至关重要的。6-BA与NAA是影响铁皮石斛原球茎诱导的主要因素,低浓度的6-BA与NAA有利于原球茎的诱导,这与张治国的研究结果不同,可能是由于原球茎诱导途径不同引起的差异。2,4-D在诱导原球茎的过程中虽然不是必要激素,但其能够缩短诱导时间,加快原球茎的增殖。在含有高浓度6-BA与低浓度NAA的MS培养基上,原球茎增殖与芽分化是同时进行的,这与郑志仁等的研究结果一致。在一定范围内,高浓度6-BA对原球茎的增殖效果较好,同时适当的加入NAA(0.3mg/L),可使芽生长健壮。因此,原球茎增殖的最佳培养基为MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L。从铁皮石斛植株上切下长2~5cm的幼嫩茎段,清水浸泡15~30min后,用刷子蘸少许洗衣粉水溶液轻轻刷洗,再用自来水充分洗净并用纱布吸干水分。在超净工作台上将茎段放置在70%的酒精中浸泡3s后,用0.1%HgCl2,2%NaClO或10%H2O2浸泡,消毒后再用无菌水冲洗5~6次后,无菌滤纸或纱布吸干外植体上的水分,竖直插入MS培养基中。试验设17个处理(表1),每个处理接种15瓶,每瓶只接种1个嫩茎,接种后15~45天内,每3天观察1次,统计感染率及生长情况。以MS为基本培养基,添加不同的激素:6-BA,NAA,IBA,2,4-D,KT。试验设计见表2,筛选出适合原球茎诱导的激素种类,再进行激素浓度选择的正交试验如表3。嫩茎经过消毒后,接种在原球茎诱导培养基中,30天后观察原球