小麦三核期切花线粒体分离纯化技术研究

小麦三核期切花线粒体分离纯化技术研究

线条是细胞中一个重要的细胞遗传因子，在维持细胞物质的能量代谢和平衡方面发挥着重要作用。自1992年oda首次宣布完全体低生长植物的完整样本线以来，高等生物线索的完整序列变得越来越重要。此外，正如所报道的，高等生物线索的完整序列包括单壳植物中的水稻（rice，或y芳，satival）、玉米（maze，zae并非所有水稻品种）、水稻品种93-11、小麦（中国北方）和拟南刺（植物）。从植物提供的信息到研究它的功能，它已从人类的角质统计到研究。现在，蛋白质群是功能基因组学的研究内容之一，由wilkin和smith于1994年首次提出。这项技术的应用在植物线条的内部平衡中显示了物质的运输、能量代谢以及与其他亚细胞的联系，尤其是线条和非生物无育机制的研究。线粒体是一种半自主性细胞器,具有独立的转录和翻译系统,其含有的蛋白质约占整个细胞蛋白质的5%~10%,在这些蛋白质中,只有2%是线粒体自身合成,而98%是由细胞核编码、经细胞质核糖体合成后运往线粒体内,其蛋白质的表达具有组织特异性和时空性.目前,对植物线粒体分离技术的研究远远落后于蛋白质检测方法所取得的进展,如何获得高纯度、完整性好、具有较高生理活性的线粒体是进行线粒体蛋白质组学研究的前提之一.迄今为止,已经探索报道了多种分离植物线粒体的方法,如蔗糖密度梯度离心法、两相法、Nycodenz、Percoll密度梯度离心法,并建立了水稻、拟南芥、豌豆等完整的植物线粒体蛋白质双向电泳体系.而目前被广泛应用的方法是差速离心结合Percoll密度梯度离心法,但由于不同植物的线粒体在大小、蛋白质含量、次生代谢物及细胞内亚细胞组分相关联程度等方面存在显著的差异;因此,探索不同植物线粒体的高纯度分离纯化技术及其蛋白质的最佳提取方法,优化蛋白质双向电泳技术对提高特异组织线粒体的分辨率仍是关键.本研究以正常发育的小麦三核期小花为材料,应用差速离心结合Percoll密度梯度离心的方法,分离纯化出了高纯度完整的线粒体,通过TCA/丙酮法提取其蛋白质,并对影响线粒体蛋白质双向电泳技术中的诸多因素进行了探讨,建立了一套适用于小麦小花高纯度线粒体分离及其蛋白质双向电泳的技术体系并进行了条件优化,以期为开展小麦线粒体蛋白质组学研究提供理论与技术支撑.1材料和方法1.1抗剥药物正常发育小麦品种西农1376,于2009年秋种植于西北农林科技大学农场试验田.2010年4月下旬,在散粉前,通过株型、穗型结合镜检来判断花药小孢子发育时期,4℃去芒和颖片后,剥取三核期小花.1.2转化法提取细胞新鲜剥取的小麦小花70g,加入700mL预冷的匀浆液[0.3mol/L甘露醇,50mmol/L焦磷酸钠,0.5%BSA(W/V),0.5%PVP-40(W/V),2mmol/LEGTA,20mmol/L半胱氨酸,pH8.0],冰浴中预冷20min,在组织匀浆仪上低速和高速间隔交替匀浆4次,每次15s,间隔30s.均匀后,用4层Miracloth过滤,滤液于4℃,3000g离心15min,取上清液,4℃,18000g离心20min,弃上清,沉淀用软毛笔悬浮于300mL的悬浮介质[0.3mol/L甘露醇,0.1%BSA(W/V)和10mmol/LTES-NaOH,pH7.5]中,重复3000g和18000g离心过程各一次.最终得到的细胞沉淀用5mL预冷的悬浮介质重悬,均匀后,4℃,1500g离心5min,上清液即为线粒体粗提液.1.3初次纯化部分—高纯度线粒体的制备将线粒体粗提液轻轻置于由3种不同浓度的Percoll与悬浮介质构成的不连续密度梯度上,自下而上分别为:5mL40%Percoll,18mL24%Percoll,10mL20%Percoll.4℃,40000g离心50min,在23%与40%Percoll分界处可见不透明浅黄色线粒体环,用注射器由下而上小心收集该部分;此即为初次纯化线粒体.然后加入5倍体积的悬浮介质,混匀后,4℃,20000g离心10min,沉淀经悬浮后铺于自形成的含28%Percoll的蔗糖缓冲液[0.3mol/L蔗糖,0.1%BSA(W/V),10mmol/LTES-NaOH,pH7.5]上,4℃,40000g离心30min.收集Percoll层顶端的线粒体条带,以1:1的体积比加入洗涤介质(0.3mol/L甘露醇,10mmol/LTES-NaOH,pH7.5),4℃,20000g离心10min,共2次;沉淀即为不含Percoll的高纯度线粒体.1.4染色体畸变后的土地层微镜观察用ZeissAxiovert200显微镜结合EppendorfTransfermanNK2显微操作仪观察詹纳斯绿B染色后的线粒体活性及纯度,通过电子显微镜进行细胞形态学观察判断线粒体的完整性.1.5蛋白质沉淀法蛋白质样品制备主要依据Damerval等方法和王书平等的方法,略有改动.在线粒体样品中加入预冷TCA-丙酮溶液[10%TCA(W/V),0.07%β-ME(V/V),1mmol/LPMSF]抽提蛋白质,-20℃过夜沉淀,期间振荡多次.4℃,30000g离心30min,弃上清,沉淀用预冷的丙酮溶液[0.07%β-ME(V/V),1mmol/LPMSF]洗涤,-20℃静置1h后,4℃,30000g离心30min,重复3~4次,直至蛋白质沉淀物为纯白色.再加入预冷80%丙酮,重悬浮沉淀,-20℃静置1h;4℃,30000g离心30min,沉淀真空冷冻成干粉.将蛋白干粉溶解于裂解缓冲液[7mol/L尿素,2mol/L硫脲,4%CHAPS(W/V),65mmol/LDTT,0.5%IPG(pH3~10/pH4~7)缓冲液(V/V),0.001%溴酚蓝(W/V)],4℃,悬浮振荡2min,液氮与30℃水浴中交替冻融3次,每融1次涡旋振荡2min,于22℃下20000g离心15min.上清液即为蛋白质样品,Bradford法测定蛋白质样品浓度.1.6等电聚焦试验固相pH梯度IEF主要参照G9rgA等方法和Bio-Rad公司等电聚焦系统指南进行.取适量蛋白质样品与水化液[7mol/L尿素,2mol/L硫脲,4%CHAPS(W/V),65mmol/LDTT,0.5%IPG缓冲液(pH3~10/pH4~7)(V/V),0.001%溴酚蓝(W/V)]共140μL/350μL充分混合,沿PROTAINIEFCell型电泳仪(BIO-RAD)聚焦槽内连续加入.将7cm(pH3~10)/17cm(pH4~7)IPG胶条胶面朝下置于样品溶液上,被动吸收1h后,加1.5mL/3mL矿物油覆盖胶条,以防止等电聚焦时尿素析出、蛋白氧化及产生冷凝水.置于IPG-phor等电聚焦仪电极板上,20℃条件下主动水化12h,设置等点聚焦程序,7cm,pH3~10IPG胶条:250V1h(线性);500V1h(线性);1000V1h(快速);4000V3h(线性);4000V20000Vh(快速).17cm,pH4~7IPG胶条:250V1h(线性);500V1h(线性);1000V1h(快速);8000V4h(线性);8000V80000Vh(快速).极限电流为50μA/胶条.第二向SDS及染色,等电聚焦结束后,迅速取出IPG胶条将胶面朝上转移至水化盘中,并依次加入平衡缓冲液Ⅰ[6.0mol/L尿素,2%SDS(W/V),0.375mol/LTris-HCl(pH8.8),20%甘油(V/V),2%DTT(W/V)(现加)]和平衡缓冲液Ⅱ[6.0mol/L尿素,2%SDS(W/V),0.375mol/LTris-HC(pH8.8),20%甘油(V/V),2.5%碘乙酰胺(W/V)(现加)],各平衡15min.然后将IPG胶条转移到SDS凝胶上,用1%低熔点琼脂糖封胶液密封排除气泡,电流20mA/胶条,待溴酚蓝前沿距玻璃板下缘0.5cm时停止电泳,硝酸银染色参照李莉等方法进行.1.7xl型光密度扫码过像银染后的2-DE凝胶应用UMAXPowerLook2100XL型光密度扫描仪透射扫描获得图像,在PDQuest2DE8.0.1分析软件包的辅助下,对图像进行背景扣除、强度校正、标准化、斑点检测、获取斑点位置坐标等分析.2结果2.1小麦花粒活性的检测分离的线粒体纯度和完整性是确保后续蛋白质组学研究质量和准确性的关键.先采用詹纳斯绿B染色的方法对其活性和纯度进行检测,该方法能迅速简便地对线粒体活性进行检测,将提取的小麦小花线粒体用詹纳斯绿B染色后,在光学显微镜下观察,可观察到蓝绿色的线粒体颗粒(Fig.1A),表明分离后的线粒体仍保持有较好的活性,且杂质少,破碎少,纯度高.电子显微镜下观察分离的线粒体外部形态饱满完整(Fig.1B).因此,经28%Percoll蔗糖缓冲液纯化后得到了有活性、较为完整且纯度较高的线粒体,适合于后续线粒体蛋白质组学研究.2.2胶的电泳分离以TCA/丙酮沉淀法提取的小麦叶片蛋白质为材料,分别采用7cm,pH3~10和17cm,pH4~7的IPG胶条,经11%SDS进行蛋白质分离,凝胶采用灵敏度高的硝酸银染色法.用pH3~10的胶条进行聚焦时,蛋白质点主要集中在pH4~7范围内,高丰度蛋白质点高度聚集重叠,模糊且不易区分,低丰度蛋白质点未能充分表达,分辨率偏低(Fig.2A).而采用17cm,pH4~7的胶条聚焦时,相同等电点范围的蛋白质点得到了更有效的分离,蛋白质点在横向上得到了拉伸,广泛分布在整个凝胶上,蛋白质点清晰,极显著地提高了分辨率(Fig.2B).研究表明,采用17cm,pH4~7的线性IPG胶条能够更好的聚焦分离小麦小花线粒体蛋白质组.2.3双向电泳图谱及数据库的选择为了使线粒体蛋白质组得到更好的分离效果,最大程度降低小麦小花线粒体中高丰度蛋白对低丰度蛋白分离效果的影响,确保高低分子量蛋白质点在2-DE图谱上充分均匀表达.对双向电泳蛋白质的上样量及SDS胶浓度做了进一步比较分析,以上述优化后的17cm、pH4~7IPG胶条,上样量分别为150μg、160μg和170μg梯度进行双向电泳,采用灵敏度高的硝酸银染色法,2-DE图谱经PDQuest2DE8.0.1软件统计分析.结果表明,上样量对蛋白质双向电泳分辨率有明显影响(Fig.3).在上样量为150μg时,双向电泳图谱上蛋白点模糊,蛋白点数量少,低丰度蛋白因不能检测到而丢失,从而影响了双向电泳的准确性和重复性(Fig.3A).在上样量为170μg时,高丰度蛋白点过大,出现过饱和重叠现象,掩盖了其余蛋白斑点,2-DE图谱上横条纹比较明显,影响了蛋白质点的分离与分析(Fig.3C).蛋白质上样量为160μg时,蛋白点清晰,无横条纹干扰,聚焦效果好,图谱质量最佳(Fig.3B).研究发现,SDS胶浓度不同,蛋白质分离的效果也存在明显差异.分别以11%和12%的SDS胶浓度进行电泳,胶浓度为12%时,虽然20.0kD以下低分子量的蛋白质在胶上得到很好的分离,而高分子量蛋白则大量聚集遮盖其他蛋白点的显示,无法得以有效识别(Fig.3C),改用11%胶后,高、低分子质量区域蛋白质点均获得了较好的分离,蛋白质点分布均匀,得到了较好的分离图谱(Fig.3B).研究确立了160μg上样量、11%SDS胶浓度更适合小麦小花线粒体蛋白质组的2-DE分离.3转化体的纯化亚细胞蛋白质组学是进行蛋白质功能和定位研究的必经之路.研究一个细胞器内表达的蛋白质组,其上游研究技术是亚细胞结构的提取和纯化即细胞的分级分离,一般细胞核沉降系数为7×106s左右,密度为1.3g/cm3;叶绿体密度为1.21g/cm3,S值为3×105;质体密度为1.22g/cm3;而线粒体沉降系数S值为1~1.7×104s,密度为1.18~1.19g/cm3.由此,细胞各组分依据浮力密度的不同而分别处于不同的密度区带上,不仅能使线粒体与细胞核、叶绿体等其它细胞器分开,而且由于完整线粒体和破碎线粒体的浮力密度不同,彼此也能很好地分开,获得纯度较高的线粒体.同时由于线粒体在细胞内结构上与其它亚细胞组分相关联,以及细胞器组成的动态性,在分离提取线粒体过程中,难免有一些非线粒体污染物,如细胞核、胞浆蛋白质的一些成分,与线粒体蛋白质一起沉降下来,从而影响线粒体蛋白质组的结果.完全排除这些非线粒体污染物是不可能的,但通过优化操作可最大程度地纯化线粒体.在小麦小花线粒体制备过程中,破碎细胞要使在能足以打破细胞壁的同时保持线粒体的完整性.本研究采用组织匀浆机低速与高速间歇交替式破碎小花组织,充分释放细胞壁包裹的线粒体、叶绿体等细胞器.与其它研究相比,本研究在离心条件上做了相应的优化,为了最大程度减少叶绿体、细胞核等的污染,在差速离心中,将低速离心力加大到3000g,使叶绿体沉淀完全;密度梯度离心前,对悬浮后的粗提液进行了低速1500g离心,以去除因线粒体与其它亚细胞组分相关联而形成的大颗粒,减少对密度梯度离心的影响;之后以优化的20%、24%、40%的Percoll密度梯度高速离心进行初步纯化,使大量完整的线粒体富集于24%与40%的Percoll分界处,再经28%Percoll自形成密度高速离心后,小心吸取Percoll层上面聚集的高纯度完整线粒体,为防止线粒体吸水膨胀破裂,用等渗的洗涤介质快速离心洗涤2次,詹纳斯绿B和电镜观察得到了纯度较高、完整且有活性的线粒体.此外,在密度梯度离心时,离心机加速一定要缓慢上升,下降时也要缓慢停下,否则会破坏Percoll梯度层的形成,影响提纯效果.其次,对试剂也进行了必要的选择,在线粒体纯化提取过程中,其提取介质包括甘露醇,PVP和BSA,甘露醇作为一种新的渗透剂代替了蔗糖,其作用是保持介质的渗透平衡,避免线粒体膨胀而破裂.在实验过程中发现,加入PVP可以有效地去除多酚,BSA的主要作用是抵抗游离脂肪酸或其它脂类物质对线粒体的毒害,如果在悬浮介质中去掉BSA,则会导致线粒体90%的活性丢失,因此,BSA在悬浮介质中必不可少;而与其它研究相比较,本研究在后续洗涤介质中,去除了BSA,其目的是避免在抽提蛋白的过程中BSA随之聚集沉淀污染线粒体蛋白.蛋白质样品的制备是双向电泳的第一步,其成功与否是决定双向电泳成败的关键;样品质量的好坏直接决定双向电泳的分辨率、重复性和蛋白质质谱的结果.为了获得更多的蛋白质信息,要求尽量提高样品蛋白质的溶解性并减少蛋白质的损失和降解.本研究采用TCA-丙酮沉淀法提取线粒体蛋白,能有效抑制蛋白酶的活性进而减少蛋白质的降解,同时可以去除脂类、色素及盐等干扰IEF的物质,富集纯化蛋白质.得到的蛋白呈乳白色,易溶解,2-DE图谱背景色干净.线粒体含有丰富的膜蛋白,这些膜蛋白对于线粒体功能的发挥具有重要作用,但是膜蛋白具有很强的疏水性,它们在普通样品裂解液中的溶解性很低.干燥后的蛋白质干粉在进行电泳前应尽可能充分溶解,在样品溶解液中常加入的试剂有变性剂、去污剂、还原剂和载体两性电解质等,这些物质都可促进蛋白质溶解.研究中通过在裂解缓冲液引入一些试剂如硫脲、CHAPS等可以增加疏水性蛋