柠檬苦素体外吸收机制的研究

柠檬苦素体外吸收机制的研究

序言（lm，图1）主要出现在各种花卉植物中。这是一种含有糊精素和高度氧化的三氟化合物。具有抗菌、抗癌、厌食症、抗炎、抗癌等活性。研究表明,LM是二甲基苯并蒽致癌的有效抑制剂。长期研究发现给予LM后能显著降低结肠癌的发病率。此外,还有研究证明LM可以抑制啮齿类动物的口腔、胃肠道、肺部以及皮肤部位的癌细胞。但LM的口服生物利用度很低,溶解度也较低,约为0.3μg·mL-1。LM在肠道内的渗透性和吸收机制至今鲜有研究报道。本文通过原位肠灌流法和体外人结肠癌细胞(Caco-2)法,研究LM的肠渗透性与吸收机制,初步阐明其口服生物利用度低的原因。其中,大鼠原位肠吸收实验保持了动物完整的血液循环、神经系统和代谢功能,且能精确控制实验的浓度、流速、pH值、渗透压和吸收范围等因素,成为研究药物吸收的最常用的在体方法之一。而完全分化的Caco-2与正常肠细胞的形态学特征极为相似,药物透过Caco-2单层细胞的渗透特征与人小肠黏膜渗透特征密切相关,因此Caco-2细胞已成为预测药物口服吸收的一种良好的体外方法。外排转运与药物进入上皮细胞的转运相反,是影响药物吸收和生物利用度的重要因素。细胞膜表面的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)以及多药耐药蛋白(multidrug-resistanceprotein,MRP)均属于糖基化膜蛋白即ABC(ATP-bindingcassette)转运器家族成员,在多种上皮细胞高度表达,故认为P-gp和MRP在药物吸收中发挥着重要作用。细胞色素P4503A4(CYP3A4)是肠细胞富含的代谢酶,由其产生的肠屏障是口服药物生物利用度的主要决定因素。本实验通过使用P-gp、MRP和CYP3A4各自的抑制剂对LM的吸收机制进行研究。准确度、精密度、回收率、细胞培养及材料在肠灌流中的添加量的确定试剂与药品柠檬苦素(纯度>95%,由浙江台州波美乐科技有限公司馈赠);DMEM培养基(Gibco公司);新生小牛血清(Sigma公司);胰蛋白酶、维拉帕米、丙磺舒、酮康唑和考马斯亮蓝G2250(Amresco公司)。动物雄性Wistar大鼠,体重160~180g,购于南京医科大学。细胞Caco-2cells(HTB37)购于AmericanTypeCultureCollection,Rockville,MD。溶液的配制灌流液的配制方法:先将一定量的LM超声溶解在10mL的二甲基亚砜(DMSO)中,用Krebs-Ringer(K-R)缓冲液缓慢稀释至100mL;再取1mL,使溶液中的DMSO终浓度为1%,加入0.05%的维生素C作为抗氧剂,以稳定灌流液。柠檬苦素的含量测定采用HPLC方法,具体条件:LC-10ATvp高效液相色谱仪(Shimadzu,日本):泵(ModelLC-10A),色谱柱(汉邦C18柱,150mm×6.0mm,i.d.),紫外检测器(ModelSPD-10A),检测波长为220nm,流动相为乙腈和双蒸水(50∶50),流速为1mL·min-1,进样体积20μL,相对保留时间在10.3min左右。该方法精密度RSD低于3.77%,回收率在96.57%~102.5%,线性关系良好(r2=0.9999),线性范围为0.4~20μg·mL-1。大鼠原位肠灌流实验大鼠禁食(不禁水)20h后麻醉,放在加热板上,打开加热灯,维持其正常体温。手术打开大鼠腹部,小心分离出待考察的肠段,即十二指肠、空肠、回肠和结肠,每段取约10cm,于两端切口插管,结扎,用预热至37℃生理盐水冲洗干净。开始时,用pH7.4K-R缓冲液以2mL·min-1的速度在待考察的小肠段灌流30min,使水分吸收达到平衡。之后用初始浓度为C0、保持37℃恒温的药液,以1mL·min-1的速度进行灌流。当LM到达所选肠段末端部位流出第1滴药液时,记录相应的时间(t0),每隔20min取样本1mL检测,并及时补充K-R缓冲液1mL。每次实验持续120min,收集的流出样品在5000×g下离心10min,取上清液进样,HPLC测定含量。实验结束后,排空肠段,测量循环液的体积,将体积减少量平均分配至每个时间段,得各个时间段的平均吸水量。根据平均吸水量,计算出各时间点循环液的体积(Vt),进而计算出各个时间点LM的剩余量,以剩余药量的对数(lnX)和取样时间(t)作图,求出表观吸收常数(Ka)和半衰期(t1/2)等参数。药物在肠内的每小时吸收百分数(P):P%=(C0×V0-Ct×Vt)/(C0×V0×t)×100%。细胞培养Caco-2细胞培养在T275组织培养瓶中,含15%新生小牛血清的DMEM培养基,在含5%CO2的37℃的孵箱中进行培养,观察细胞生长状态,将生长至80%~90%细胞培养瓶内的培养液弃去,用0.25%胰酶溶液浸润2~3min,加入含有小牛血清的DMEM培养基停止消化,吹打细胞成悬液。然后接种在24孔板上,接种细胞数为105/cm2,待细胞单层膜铺满后开始实验。Caco-2细胞吸收实验实验开始前2h弃去培养液,用1mL37℃PBS冲洗3次,除去细胞表面的杂质,37℃下孵化10min,轻轻吸干PBS,然后每孔加入300μmol·L-1LM0.5mL,37℃下培养细胞,分别在10、30、60、90、120和150min后倾出药物,细胞用4℃PBS清洗3次,然后每孔加入双蒸水1mL。在-30℃下持续冷冻15min,之后在50℃下加热2min,如此循环重复3次,吹打细胞,取细胞悬液0.25mL,加入0.25mL乙腈以沉淀蛋白,离心后HPLC检测LM浓度。另取细胞悬液0.4mL,用考马斯亮蓝法定量蛋白。LM的吸收以每毫克蛋白所吸收的药量确定。其中HPLC的测定条件同前所述,空白细胞悬液对含量测定无干扰,LM保留时间基本不变。在空白细胞中加入不同浓度的药物,如上法操作,所得标准曲线线性良好(r2=0.9985),回收率大于96%,精密度RSD低于4.0%,方法可靠。通过摄取含量-时间曲线,确定药物的最大吸收时间,同样方法测定LM的给药浓度在50~500μmol·L-1内变化的浓度-摄取曲线。之后,分别预先加入3种抑制剂,维拉帕米(P-gp抑制剂)、丙磺舒(MRP抑制剂)、酮康唑(CYP3A4抑制剂)作用60min,再加入LM,考察影响LM吸收的机制。数据分析所有数据都以x±s表示,用t检验进行统计分析。结果1吸收速率及吸收百分率测定LM的质量浓度分别为4.0、8.0、12.0μg·mL-1,大鼠吸收速率常数(Ka)及每小时吸收百分率(P)的测定结果见表1。结果表明,浓度对LM的吸收没有显著性影响,说明LM的吸收途径不是单纯扩散。2收情况分析8.0μg·mL-1LM在不同肠段的吸收情况见表2。结果表明,LM在4个肠段(十二指肠、空肠、回肠、结肠)的Ka和P值均没有显著性差异,LM在整个肠段都有吸收。3lm的时间-摄食时间及峰浓度用300μmol·L-1LM与Caco-2细胞进行孵育,在不同时间细胞内LM的含量测定结果见图2。由图2可见,LM的时间-摄取曲线随时间延长,细胞内摄取量先增大、后减少。曲线在90min时达到峰顶,其峰浓度为(13.8±3.17)μmol·g-1(protein)。90min前摄取量和时间基本呈正比,近似一级吸收,90min后摄取量下降,可能是由于细胞的外排。4细胞内药物浓度不同浓度的LM(50~500μmol·L-1)在37℃下与Caco-2细胞孵育90min,细胞内药物含量如图3所示。随着LM浓度的增加,细胞内的药物浓度也增加,当给药浓度大于300μmol·L-1后,LM的吸收达到稳态最大吸收浓度,存在饱和现象。这进一步验证了LM的吸收不是单纯扩散,可能为促进扩散。5细胞内累积药物Caco-2细胞分别在37℃下不同浓度的维拉帕米、丙磺舒和酮康唑溶液内预孵化60min,然后加入300μmol·L-1LM溶液,孵育90min,细胞内的累积药物浓度如表3所示。可以看出,维拉帕米和酮康唑能够显著提高LM在Caco-2细胞的吸收,呈剂量依赖性,而丙磺舒的效果不明显。结果表明,LM的吸收主要受到P-gp和CYP3A4的调节,而与MRP调节的药物转运无关。柠檬苦素的吸收本实验采用平均吸水量法测定各时间段肠段的吸水量,避免了酚红在循环液中褪色导致的测量不准确。通过原位肠灌流实验,发现柠檬苦素的肠吸收极低,可能不是简单的被动扩散方式。柠檬苦素在十二指肠、结肠、回肠和盲肠的吸收速率常数Ka和P值没有显著性差异,说明柠檬苦素在肠段的吸收没有明显的部位靶向性。Caco-2细胞的实验结果证实了柠檬苦素的吸收有饱和现象,因此其吸收机制可能为促进扩散。进一步的实验证明维拉帕米和酮康唑能够以剂量依赖的方式显著提高柠檬苦素的吸收,而丙磺舒对柠檬苦素吸收的改善效果不明显,说明柠檬苦素的吸收主要受P-gp和CYP3A4的调节,而与MRP调节的药物转运无关