维帕米预处理对黄土鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

维帕米预处理对黄土鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

目前，对脑损伤再注射损伤的发病机制尚不清楚。许多科学家认为，这是一种多路径的损伤机制，包括能量代谢障碍、微循环障碍、细胞内钙含量超标、自由基损伤、兴奋性氨基酸异常等。其中脑缺血可以引起Ca2+超载,而Ca2+超载又可引起并加重脑缺血损害,二者形成恶性循环,因而细胞内Ca2+超载被认为是脑缺血再灌注损伤最重要的作用机理之一。维拉帕米(异搏定)是较早被研究的钙通道阻断剂,临床已广泛用于治疗心血管疾病。有实验证实维拉帕米对脑缺血损伤后的脑组织也有一定的保护作用,但关于它用于药物预处理的脑保护研究,目前还未见相关报道。本实验在不同时间点对沙土鼠行维拉帕米预处理,观察沙土鼠缺血损伤后超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)的活性、内皮素(ET)和降钙素基因相关肽(CGRP)等生化指标以及形态学的改变,来探讨其对沙土鼠的脑保护机制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1随机分组及分组33只蒙古种沙土鼠(昆明药理重点实验室提供),月龄3个月,体质量42~75g,随机分为对照(A)组、脑缺血再灌注损伤(B)组、维拉帕米预处理(C、D、E)组,A、B组各为6只,C、D、E组各为7只。C、D、E组在脑缺血前48、24、12h分别予2.5%维拉帕米(2mg/kg·b.w.)腹腔注射,并观察动物的注药反应。1.1.2试剂盒和试剂盒2.5%维拉帕米注射液由上海禾丰制药有限公司生产,SOD试剂盒、GSH-px试剂盒和MDA试剂盒由南京聚力生物医学工程研究所提供,ET试剂盒和CGRP试剂盒由天津九鼎医学生物工程有限公司提供。1.2方法1.2.1成模模式及程序所有动物均在2.5%戊巴比妥钠(40mg/kg·b.w.)腹腔注射麻醉下行双侧颈总动脉分离术。A组不行脑缺血处理,其余各组用动脉夹夹闭双侧颈总动脉20min,造成沙土鼠前脑缺血,随后开放血管夹恢复血流,再灌注50min,即制成沙土鼠脑缺血再灌注动物模型。上述操作完毕后,将所有动物立即处死,冰玻上断头,分离出左、右大脑皮层(厚约2mm),去除血管和硬脑膜,分装入液氮储存管保存于液氮中待用。1.2.2酸ph值的测定方法取右侧前大脑皮层组织,吸去血迹,称质量,尽快放入0.1mol/L乙酸1ml略做研磨,然后在100℃水浴中煮沸10min,取上清于-20℃保存待测。测定时用磷酸缓冲液(PBS)5倍稀释,以调节pH值。ET与CGRP的含量均采用放射免疫方法测定。1.2.3水溶液研磨法取左侧前大脑皮层组织,吸去血迹,称重,在冰玻上按1∶4与生理盐水研磨制成匀浆,4℃3000r/min离心15min,取上清液于液氮中保存待测。SOD活性、GSH活性及MDA含量测定均采用比色法。1.2.4透射电镜观察每组随机选取一只沙土鼠,在冰玻上取左颞前叶脑组织切成大小约1mm×1mm小块,依次经3%戊二醛和1%四氧化锇双重固定、梯度丙酮脱水、环氧树脂618与丙酮浸透、环氧树脂618包埋、LKB-V型超薄切片机切片、醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色后,行透射电镜观察。1.2.5统计分析测定值用均数±标准差表示,采用SPSS10.0软件分析数据,组间比较用F和q检验,以P<0.05为显著性差异。2结果2.1各组的sod活性、mda含量比较各组脑组织匀浆SOD、GSH、MDA值的比较见表1。与A组比较,B组SOD及GSH活性明显低下,而MDA含量显著增高;与B组比较,维拉帕米预处理各组的GSH活性均显著高于B组,C、D组的SOD活性显著高于B组,E组的SOD活性高于B组,但无统计学意义;C、D组的MDA含量显著低于B组,E组的MDA含量低于B组,但无统计学意义。维拉帕米预处理各组从均值看,E组的SOD、GSH活性高于其它预处理组,而MDA含量低于其它预处理组,但它们的差异不具有统计学意义。各组脑组织匀浆中ET、CGRP、ET/CGRP比值比较见表2,与A组比较,B组ET、ET/CGRP比值显著高于A组,CGRP含量显著低于A组;与B组比较,维拉帕米预处理各组的ET、ET/CGRP比值均显著低于B组,CGRP含量高于B组,但差异不具有统计学意义;维拉帕米预处理各组中,E组的ET、ET/CGRP比值低于其它组,但它们之间无显著性差异。2.2拉克氏原螯虾胞质正常对照组的大脑皮质细胞超微结构正常,细胞膜规整清晰,细胞质比较均匀,线粒体嵴较多且排列整齐,线粒体膜完整(图1);缺血组细胞膜明显肿胀扩张,有皱折表现,内质网肿胀扩张,甚至有空泡状改变,线粒体肿胀破裂,线粒体嵴断裂消失(图2);维拉帕米预处理48h组胞膜清晰无皱折,细胞质比较均匀,线粒体嵴仅部分断裂,内质网及高尔基体无或仅轻度肿胀扩张(图3);24h组胞膜较规则,胞质稍疏松,线粒体嵴部分断裂,内质网略肿胀(图4);12h组的细胞质疏松较明显,细胞膜有轻微皱折改变,线粒体嵴断裂、消失,有空泡改变,内质网肿胀较明显(图5)。3基于抗氧化磷酸化过程的活性成分变化钙通道阻滞剂是一类选择性阻滞电压依赖性钙通道,抑制细胞外Ca2+经慢通道进入细胞,降低细胞内Ca2+浓度的药物,因而可消除上述有害因素,有一定的脑保护作用。本实验应用维拉帕米作预处理来研究其在脑缺血再灌注损伤中的脑保护作用。SOD和GSH是中枢神经系统中重要的抗氧化酶,SOD能清除超氧阴离子自由基O2-,GSH能清除H2O2。如果SOD活性增高而不伴有GSH活性的升高,则使生成的H2O2不能及时被清除而转化为·OH,因此,SOD的活性升高反而有害。本实验结果表明,脑缺血再灌注组,这两种酶的活性均显著下降,可能是ATP耗竭不能提供足够的能量,氧自由基对酶的直接破坏作用。给予维拉帕米预处理能够同时抑制这两种酶活性的下降,其中以48h预处理的作用最强。推测其机理为:维拉帕米通过抑制钙内流,恢复氧化磷酸化过程,从而增强了SOD和GSH的活性以及减轻了氧自由基对抗氧化酶的破坏作用。MDA是一种脂质过氧化的终产物。脑组织中富含脂质且所含的抗氧化酶较少,在脑缺血缺氧时容易受到氧自由基的攻击,发生脂质过氧化反应,产生一些中间产物,并降解成一些小分子终产物,如醛类、酮类及羧酸等,尤以醛类中的MDA最为重要,往往把MDA作为衡量脂质过氧化和氧自由基损害程度的重要指标。MDA产生后可以与细胞膜蛋白上的氨基及巯基发生反应,导致膜蛋白的交联和凝聚,使膜蛋白失去活性,从而丧失转运功能,导致细胞内外离子交换障碍引起钙离子的超载,引起脑组织细胞的病理性损伤。本实验显示,脑缺血再灌注后沙土鼠脑组织中的MDA水平显著增高,说明脑组织缺血后使脑内脂质过氧化程度明显加剧。而维拉帕米预处理能降低脑缺血再灌注损伤时脑组织的MDA水平,从而减少MDA对脑组织的损害,且以48h预处理的作用最强,表明氧自由基对多价不饱和脂肪酸的攻击减少,脂质过氧化水平降低,而这种保护作用的高峰出现在给药后48h左右。脂质过氧化水平的降低也提示维拉帕米能够降低脑内氧自由基的含量,维拉帕米的神经保护作用与降低脂质过氧化水平密切相关。脑缺血时,内皮细胞受到强烈刺激,导致ET异常表达和释放增加。在动物实验中也发现脑缺血急性期血浆ET浓度增高,且与缺血脑组织中的变化相一致。而且,神经系统损害越严重,血浆ET水平越高,血浆ET含量与疾病严重程度呈正相关趋势。CGRP被认为是内源性ET拮抗剂,是迄今所知体内最强的舒血管物质,广泛分布于中枢和外周神经系统及脑血管系统,对脑血管舒缩功能调节有着重要作用。ET、CGRP作用相反,又呈相关性,正常情况下两者保持相对稳定,呈动态平衡,脑缺血时平衡失控,引起强烈持久的相互拮抗,使脑血管处于收缩状态,脑组织损伤加重。本实验结果表明,维拉帕米预处理可明显减轻脑缺血后脑组织ET水平,增加CGRP水平。临床上评价脑保护措施的效果,都是以能否降低死亡率、能否改善脑缺血缺氧所引起的中枢神经系统损害后果为标准,而在实验室则以能否减轻或避免缺血