缝隙连接参与缺血复灌大鼠心肌传导功能的影响

缝隙连接参与缺血复灌大鼠心肌传导功能的影响

所谓死亡后出血，是指患者在重新注册的初始阶段立即给患者进行反复修剪，对心肌的缺血性和重新灌木的损伤有明显的保护作用。但缺血后处理的心肌保护作用机制尚未完全清楚。近几年来的研究表明,缝隙连接(gapjunction)通讯参与缺血/复灌心肌的保护作用。缝隙连接是存在于相邻细胞间的膜通道结构,由相邻的两个细胞质膜上的连接子相互衔接而成,缝隙连接对心肌细胞电同步兴奋和代谢耦联起着重要作用,同时缝隙连接通讯也受到一些药物的影响,如庚醇(heptanol)。庚醇是一种脂溶性的缝隙连接脱耦联剂,能可逆地抑制缝隙连接。研究发现,庚醇可以发挥类似心肌缺血预处理的效应。据报道,缺血后处理与缺血预处理存在一些共同的保护机制。笔者假设,在缺血后处理的心肌保护作用中,可能与预处理共享缝隙连接机制。本实验旨在探讨缝隙连接是否参与缺血后处理的心肌保护作用。1材料和方法1.1ttc公司庚醇(heptanol),氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazoliumchloride,TTC)为Sigma公司产品;H2N-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH2(AAP10)委托成都川抗派德生物医药科技有限公司合成。1.2特氟纶左心室SD大鼠,♂,体重220～280g[由浙江省医学科学院提供,动物编号:SCXK(浙2003-0001)],断头后迅速取出心脏,置于4℃改良Krebs-Henseleit(K-H)液中洗净血液,迅速转移、固定于Langendorff灌流装置,以改良K-H液行常规恒压(76mmHg)灌流。改良K-H液成分(mmol·L-1):NaCl118.0,KCl4.7,K2PO41.2,MgSO41.2,NaHCO325.0,CaCl21.25,葡萄糖10.0g,pH7.3～7.4,以95%O2+5%CO2饱和,维持灌流液温度37℃。切开左心耳,将充水乳胶囊插入左心室,囊内压力经特氟纶管传递至压力传感器,由MedLab生物信号采集处理系统记录和分析。向插入左心室内的乳胶囊注水使左心室舒张末压(leftventricularend-diastolicpressure,LVEDP)维持于4～8mmHg,连续记录左心室发展压(leftventriculardevelopedpressure,LVDP)、心率(heartrate,HR)、心率与发展压的乘积(rate-pressureproduct,RPP)、左心室内压最大上升和下降速率(maximalrise/fallrateofleftventricularpressure,(dP/dtmax)等指标。测定复灌各时间点单位时间的冠脉流量。在复灌各时间点收集冠脉流出液,采用分光光度法测定乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)的含量。1.3联轴复灌/停灌循环本模型采用冠脉结扎法。暴露左心耳和动脉圆锥之间表浅冠状静脉下方的左冠脉,用针、线绕过冠脉下方后,两个线头穿过一段细硅胶管,然后在另一小段细硅胶管上打结结扎,松开结扣作为复灌处理,以结扎30min,复灌120min作为缺血/复灌过程,在停灌后复灌即刻立即给予3次复灌/停灌循环,每次10s共计1min,实现缺血后处理。1.4心肌面积测量采用TTC染色法测定梗死面积,扫描仪扫描后使用ImageJ软件(美国NIH)计算以梗死区面积占危险区面积的比例。1.5复灌和停灌循环本模型采用全心停灌30min复灌120min的处理方法,在停灌后复灌即刻立即给予6次全心复灌/停灌循环,每次10s共计2min,实现缺血后处理。1.6丢失的心律得分法采用心律失常评分法对心律失常严重程度进行定量分析,具体评分办法见表1。1.7心外膜下插设电极SD大鼠断头后开胸迅速取出心脏,置于4℃改良K-H液中洗净血液,迅速转移、固定于Langendorff灌流装置,以改良K-H液行常规恒压灌流。心外膜下插置3对电极,由外涂绝缘层特氟龙的不锈钢丝制成,右心室垂直方向置起博电极一对,左心室方向置记录电极两对,两对电极纵向排列固定在一个干胶片上,每个内电极相距2.5mm。电极插入时,其纵行方向平行于心室肌纤维的纵轴,另有接地电极一支插入灌流管口附近溶液中。以起搏频率5Hz和两倍于舒张期阈值的电压起搏,测出两对记录电极所记录到心外膜电图的起始点的时间差,取连续5个起搏周长的时间差作为计算值,将传导距离除以该值即为传导速度。1.8实验组1.8.1复灌初期系统大鼠随机分为10组,每组6只。①I/R组(ischemia/reperfusion,I/R):心脏平衡20min后,结扎左冠状动脉前降支30min,然后复灌120min;②缺血后处理组(ischemicpostconditioning,Postcond组):同I/R组,但在复灌初期立即给予反复3次短暂的冠状动脉前降支复灌/缺血的循环,每次10s,共计1min;③庚醇后处理组:同I/R组,但在复灌初期分别以浓度为0.05,0.1,0.5,1.0mmol·L-1的缝隙连接脱耦联剂庚醇灌流15min;④I/R+AAP10组:同I/R组,但在复灌初期同时给予缝隙连接开放剂AAP10(1×10-7mol·L-1)灌流15min;⑤Postcond+AAP10:同Postcond组,但在复灌初期同时给予AAP10(1×10-7mol·L-1)灌流15min;⑥庚醇预处理组:同I/R组,但在结扎冠状前给予0.5mmol·L-1庚醇的K-H溶液继续灌流15min;⑦庚醇+AAP10组:同庚醇预处理组,但在复灌初期立即给予浓度为1×10-7mol·L-1的AAP10灌流15min。1.8.2复灌和停灌时间大鼠随机分为9组,每组6只。①对照组:心脏稳定20min后,继续灌流15min;②AAP10组:心脏稳定20min后,继续分别以浓度为1×10-6、1×10-7、1×10-8mol·L-1的AAP10灌流15min;③I/R组:心脏平衡20min后,全心停灌30min,然后复灌120min;④Postcond组:同I/R组,但在复灌初期立即给予反复6次短暂的全心复灌/停灌的循环,每次各10s,共计2min;⑤庚醇后处理组:同I/R组,但在复灌时分别以浓度为0.05、0.1、0.5、1.0mmol·L-1的庚醇灌流15min;⑥I/R+AAP10组:同I/R组,但在复灌初期同时以浓度为1×10-7mol·L-1的AAP10灌流15min;⑦Postcond+AAP10组:同Postcond组,但在复灌初期同时以浓度为1×10-7mol·L-1AAP10的K-H液灌流15min;⑧庚醇预处理组:同I/R组,但在停灌前给予0.5mmol·L-1的庚醇继续灌流15min;⑨庚醇预处理+AAP10组:同庚醇组,但在复灌时以浓度为1×10-7mol·L-1的AAP10灌流15min。1.9统计分析实验数据以ˉx±s表示,采用One-wayANOVA和Newman-Keuls法进行统计学分析。2结果2.1复灌期间ldh含量与I/R组相比,缺血后处理组LVDP、RPP明显增高、±dP/dtmax增大、冠脉流量增多,复灌期间冠脉流出液中LDH含量降低,结果见图1,表2。复灌期间心律失常评分下降,结果见表3,心肌传导速度降低,结果见图2,心肌梗死面积明显减小(I/R组49.11%±18.29%,缺血后处理组25.51%±8.94%,P<0.05)。2.2各组大鼠心肌梗死范围、ldh、l-1、3.复灌初期分别给予0.05,0.1,0.5,1.0mmol·L-1的庚醇,与I/R组相比,各庚醇组使心肌复灌过程中心律失常评分下降,结果见表3,高浓度庚醇(0.1～1.0mmol·L-1)使心肌梗死范围缩小(I/R组49.11%±18.29%,0.1mmol·L-1庚醇组27.93%±1.38%,0.05mmol·L-1庚醇组21.26%±5.00%,1.0mmol·L-1庚醇组16.24%±3.44%,三组P<0.01),复灌期间冠脉流出液中LDH含量降低,传导速度降低,结果见图3、4。2.3增加了1.0.0.05的心肌传导速度1×10-6,1×10-7,1×10-8mol·L-1的AAP10分别使心肌的传导速度(m·s-1)由正常时的1.05±0.05增加到1.13±0.04(P<0.05),1.30±0.05(P<0.01),1.43±0.11(P<0.01),并呈剂量依从性关系。2.4复灌期心律失常评分与I/R组相比,AAP10+I/R组的RPP,LVDP,±dP/dtmax和冠脉流量、LDH含量、心肌梗死面积无明显变化,结果见图1,表2,但明显降低了复灌期各时间点的心律失常评分,结果见表3,增加复灌30min前的心肌传导速度,结果见图2。2.5活检后处理的作用复灌初期同时给予1×10-7mol·L-1的AAP10取消了缺血后处理增高复灌期RPP,LVDP,±dP/dtmax的作用,结果见表2,取消了缺血后处理增加冠脉流量和降低冠脉流出液中LDH释放的作用,结果见图1,表2,取消了缺血后处理降低心律失常评分的作用,结果见表3,也取消了缺血后处理缩小心肌梗死面积的作用(缺血后处理组25.51%±8.94%,AAP10+缺血后处理组44.79%±14.77%,P<0.05)。复灌时心肌传导速度比缺血后处理组加快,结果见图2。2.6复灌初期心律失常评分的影响复灌初期同时给予1×10-7mol·L-1的AAP10,减弱了庚醇缩小心肌梗死面积的作用(庚醇组6.96%±3.69%,庚醇+AAP10组43.97%±8.67%,P<0.01),减弱了庚醇降低心律失常评分的作用(庚醇组0.88%±0.64%,庚醇+AAP10组2.0%±0.89%,P<0.05),也减弱了庚醇降低复灌初期的心肌传导速度的作用,结果见图5。3缝隙连接的生理参数及体外传导速度的影响本实验在离体心脏灌流模型上发现,缺血后处理可明显改善灌注后左心室收缩功能,增加缺血/复灌后冠脉流量,减少心肌损伤标志酶LDH的漏出,减少心肌梗死面积,减少复灌期间心律失常的发生,缝隙连接脱耦联剂庚醇也有类似作用,这种心肌保护作用可被缝隙连接开放剂AAP10所阻断,提示缝隙连接可能参与了缺血后处理的心肌保护作用。缝隙连接是相邻细胞之间的连接通道,低分子量物质可以自由通透,电位变化也可以进行传递,不论是化学耦联或电耦联均可使信息通过缝隙连接传到另一细胞,起到细胞间通讯的作用。近年的研究表明,心肌细胞间的电耦联对心脏兴奋冲动的传导速度起着关键的决定性作用,因此,在决定传导速度方面,缝隙连接通道起到了重要的作用。在本实验中,笔者采用的测定电兴奋在心室肌细胞的传导速度可以间接反映心肌细胞间缝隙连接电耦联的情况。在实验中,笔者发现经缺血后处理的心肌,在复灌期间心肌传导速度明显减慢。不同剂量的庚醇在复灌期间心肌传导速度也呈现不同程度的减慢,同时,这些作用都可以被缝隙连接开放剂AAP10取消或减弱。AAP10的作用机制是增加细胞缝隙连接的传导性,而对心肌细胞的其他电生理参数没有明显影响。在实验中笔者观察到AAP10增加心肌的传导速度,并呈剂量依从性,表明AAP10可增加缝隙连接细胞间电通讯;另外,AAP