不同毒素对烟草幼苗抗病相关酶系活性及细胞膜透性的影响

不同毒素对烟草幼苗抗病相关酶系活性及细胞膜透性的影响

卷烟是一种重要的耕作。中国种植面积约166.7万公顷。近年来，卷烟病虫害的发生给烟草行业的产量造成了巨大损失，并受到了严重影响。病害种类也逐渐增加,其中烟草镰刀菌(Fusariumsp.)根腐病属于具有潜在性危害的一种病害,常伴随烟草青枯病、黑胫病等根茎类病害混合发生,给烟叶生产带来毁灭性的损失。镰刀菌属土壤习居菌,种类繁多,世界性分布,可侵染多种植物(粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物)引起植物的根腐、茎腐、花腐和穗腐等。镰刀菌产孢能力很强,孢子传播途径很多,除土传外还可以通过空气传播,侵染植物维管束系统,破坏植物的输导组织。许多研究表明镰刀菌在植物的生长发育过程中还产生毒素,造成植物萎蔫死亡。镰刀菌病害在生产上属于防治最困难的重要病害之一,目前主要采用抗病育种及生物防治方法,但这些方法的使用因条件限制有一定程度的局限性。化学防治只能以预防为主,植物一旦受到侵染其治病效果甚微。只有充分认识到病原菌对植物的作用机理,才能找到最经济、有效、环保的防治措施。镰刀菌引起的植物病害已受到世界范围的关注,但目前对镰刀菌的侵染机制研究仍处于探索阶段。该类病原菌在烟草上的相关研究极少,其对烟草的致病作用尚无相关报道。探求镰刀菌在烟草上的作用机理对未来烟草镰刀菌根腐病的防治工作有重要的意义。一直以来毒素都被认为是一类重要的致病因子,对植物组织有明显的损伤作用。本文针对镰刀菌产生的毒素进行了系统研究,以探明镰刀菌毒素在侵染烟草过程中的毒害作用。1材料和方法1.1材料表面1.1.1sariumso造林本试验所用病原菌由山东烟田典型根腐病病株分离获得,经鉴定为茄病镰刀菌[Fusariumsolani(Mart.)Sacc.]和尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchlecht),菌株由中国农业科学院烟草研究所植保室王静老师提供。尖孢镰刀菌编号为f101,茄病镰刀菌编号为f90。1.1.2u3000gPDA:马铃薯300g,葡萄糖20g,琼脂18g,蒸馏水1L。PSC培养液:蔗糖30g,硫酸镁0.5g,蛋白胨10g,磷酸二氢钾1g,硫酸亚铁0.01g,氯化钾0.5g,蒸馏水1L。1.1.3试验材料烟草(品种为‘红花大金元’和‘小黄金’)及其他作物种子包括大豆、豌豆、萝卜、白菜。1.2测试方法1.2.1psc的培养供试f101和f90菌株分别在PDA平板上活化,打取直径为5mm菌饼,并转接到盛有800mLPSC培养液的1L三角瓶内,每瓶32片,置摇床25℃下振荡培养(120r/min)15d。培养液经纱布过滤后8000r/min离心15min,弃沉淀留上清。该上清即为培养滤液,4℃保存备用。1.2.2毒素粗提物的溶解乙酸乙酯萃取培养滤液,每次以1∶1的比例萃取3次,然后将3次萃取所得的有机相合并,旋转蒸发仪浓缩萃取液,得到毒素粗提物,用80mL100℃的无菌水溶解毒素粗提物。800mLPSC培养滤液的提取物加80mL无菌水制成的粗毒素液作为毒素原液(100%)。1.2.3德国考察中粗毒素的生物活性1.2.3.胚根长度测定采用烟草种子发芽抑制试验测定粗毒素的活性。烟草种子经NaClO表面消毒,在28℃下催芽,待种子破壁露白后,摆在铺有毒素原液浸湿的滤纸的培养皿内,置于28℃恒温下,培养7d,测量胚根长度。每处理每品种50粒种子,3次重复,清水处理为对照。1.2.3.两菌毒素的比用两叶一心的‘小黄金’烟草幼苗,洗净根部经无菌处理后移入致病菌毒素的小试管内,毒素液共设5个浓度梯度,用毒素与无菌水的体积比依次表示为1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、0∶1,48h后观察幼苗发生萎蔫的时间与程度。每处理3株幼苗,3次重复。1.2.4对侧杆菌粗毒素的主观专化性供试作物为大豆、豌豆、萝卜、白菜。测定方法同1.2.3.1。1.2.5幼苗生长试验烟草种子常规消毒后播种,10d后假植,30d后取用。选取长势一致且健康的幼苗用于试验。浓度为50%的毒素浸泡挑选好的幼苗,间隔12h取适量的幼苗用于试验,直至60h停止试验。1.2.5.光合光密度值测定称取幼苗根部1.0g,剪碎,置于预冷的研钵中加适量的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.6)研磨成匀浆,4℃下8000r/min离心20min,上清转入100mL容量瓶中,残渣用磷酸缓冲液再提取一次,合并两次的上清,定容至刻度,低温保存。配制反应混合液,0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.5)50mL于烧杯中,加入愈创木酚28μL,搅拌至愈创木酚溶解,最后加入30%的过氧化氢19μL,混合均匀,4℃保存备用。采用UV2300分光光度计测定光密度值,以反应混合液3mL作为对照,测量时反应混合液3mL加入待测酶液50μL,立即计时,记录每1min波长470nm下的光密度值。过氧化物酶活性(U/min)=ΔA470×Vtm×Vs×0.01×t过氧化物酶活性(U/min)=ΔA470×Vtm×Vs×0.01×t公式中ΔA470为反应时间内光密度值的变化;m为幼苗根部鲜重(g);Vt为提取酶液总体积(mL);Vs为测定时取用的酶液体积(mL);t为反应时间(min)。1.2.5.多酚氧化酶活性u/1的测定称取幼苗根部1.0g,剪碎,置于预冷的研钵中加适量的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.6)研磨成匀浆,4℃下8000r/min离心20min,上清转入100mL容量瓶中,残渣用磷酸缓冲液再提取一次,合并两次的上清,定容至刻度,低温保存。参比液为2.0mL0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.6)和1.0mL0.02mol/L儿茶酚溶液,反应液为参比液加100μL的待测酶液,酶液加入时立即计时,记录每分钟分光光度计波长390nm的光密度值。公式如下:多酚氧化酶活性(U/min)=ΔA390×Vtm×Vs×0.01×t多酚氧化酶活性(U/min)=ΔA390×Vtm×Vs×0.01×t公式中ΔA390为反应时间内光密度值的变化;m为幼苗根部鲜重(g);Vt为提取酶液总体积(mL);Vs为测定时取用的酶液体积(mL);t为反应时间(min)。1.2.6不同浸泡时间对组织膜电导率的影响幼苗的处理方法同1.2.5中的处理方法。采用电导法测定细胞膜透性。烟草幼苗冲洗干净再用无菌水冲洗备用。试验设为2个处理:处理1为50%尖孢镰刀菌毒素,处理2为50%茄病镰刀菌毒素。浸泡处理的时间为0、24、30、36、48、54h,浸泡时间0的作为对照。将浸泡好的幼苗分别清洗干净,再用去离子水冲洗,滤纸吸干后,剪掉根部和叶片,分别称取0.5g,放入25mL去离子水中,在35℃恒温水浴锅中保温处理20min,期间不断搅拌,室温测定幼根和叶片浸出液的电导率,最后将处理的材料煮沸15min,冷却至室温测定细胞膜彻底破坏的浸出液的电导率值,根据公式,计算毒素处理组织细胞膜的损伤率。相对电导率(％)=毒素处理电导率煮沸组织电导率×100。相对电导率(％)=毒素处理电导率煮沸组织电导率×100。2结果与分析2.1毒素的生物活性测定2.1.1对‘麻黄大金’和‘红无金’种子胚根生长的抑制率毒素原液处理‘红花大金元’、‘小黄金’两个品种。结果表明,毒素对烟草种子的胚根生长有明显的抑制作用;尖孢镰刀菌对‘红花大金元’种子胚根生长的抑制率48.25%,对‘小黄金’的种子胚根生长抑制率达57.41%;茄病镰刀菌对‘红花大金元’种子胚根生长的抑制率48.74%,对‘小黄金’的抑制率仅有24.2%。结果显示,烟草不同品种对毒素的抗性不同,不同镰刀菌毒素在同一个烟草品种的表现亦不同。2.1.2烟草幼苗病变的反应毒素浸泡幼苗一段时间后,幼苗会出现根尖变色湿腐状,参考分级标准,将镰刀菌毒素对烟草幼苗(品种为‘小黄金’)的作用分为以下几个级别。“-”无反应:整株烟苗无萎蔫,健康良好;“+”轻度反应:烟草幼苗侧根变色,或老叶下垂;“++”中度反应:烟草幼苗主根变黄变黑,侧根数量不变或新叶下垂;“+++”重度反应:整株烟苗萎蔫。结果如表1所示,幼苗的发病如图2所示。从幼苗的发病症状可以看出,f90处理过的幼苗根系无新侧根生成,甚至根部还没来得及生长维管束就失水萎蔫死亡了,而f101处理的幼苗根部继续生长但明显比对照的慢,且根部出现黄色腐烂状,地上部叶片伴随着下垂,萎蔫。根据幼苗根部的反应,可以看出f90和f101的致病方式不同。结合幼苗的萎蔫试验和种子胚根抑制试验结果来看,两者得到的结果基本一致,f90的致病作用都比f101的强烈。f90和f101都是随着处理浓度的降低,对幼苗的致病作用减轻。2.2fpsg1对f00的不同抑制率试验结果表明,引起烟草根腐病的尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌毒素对不同作物种子胚根的生长也有明显的抑制作用。f90处理组中抑制作用强弱依次为萝卜、白菜、黄豆、豌豆,其中对萝卜的胚根抑制率最高为69.44%,对豌豆胚根抑制率最低51.06%;f101处理组中抑制作用强弱依次为白菜、萝卜、豌豆、黄豆,其中对白菜胚根抑制率最高为75.28%,对黄豆胚根的抑制率最低为36.99%。由此,结合2.1.1的结果说明尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌毒素都是非专化性毒素,不仅对烟草有诱发和毒性作用,对其他作物也有相当的毒性作用。2.3刀菌素对烟草幼苗的根部抗病酶系统的影响2.3.1下降0.10%在尖孢镰刀菌毒素浸泡12～36h后,烟苗体内的过氧化物酶活性迅速升高达到最大值,随后缓慢下降。茄病镰刀菌毒素浸泡的烟苗,过氧化物酶活性在12h要比同一时间尖孢镰刀菌毒素浸泡的烟苗体内过氧化物酶活性高59.75%,在48h内其过氧化物酶活性水平较高,至60h,酶活性有降低趋势。2.3.2烟苗多酚氧化酶活性的变化两种毒素浸泡12h后烟苗体内多酚氧化酶活性基本一样,之后的变化整体趋势一致,在36h都达到最大值,但茄病镰刀菌毒素处理的烟苗多酚氧化酶活性变化快于尖孢镰刀菌毒素处理的,相对于尖孢镰刀菌毒素,最高点活性高达25.06%。2.4不同促花处理对烟苗膜损伤率的影响50%毒素处理烟苗后根部及叶片细胞膜的透性变化如图5。随着处理时间的延长,根部和叶片的细胞膜透性均呈现上升趋势,说明毒素作用的时间越长对烟苗细胞膜的损伤越大;从根部细胞膜损伤率图可以看出,在30h后f101和f90毒素处理的烟苗根部细胞膜的损伤率虽呈上升趋势但变化缓慢,在54h时根部细胞膜的损伤率比对照增加了80%左右。在48h之前两种毒素处理的细胞膜损伤率变化比较快,在48h后尖孢镰刀菌毒素处理的叶片细胞膜损伤率变化趋缓,而茄病镰刀菌毒素处理的叶片损伤率仍然为上升的趋势,在54h时处理的叶片细胞膜损伤率比对照增加了90%以上。3毒素对烟草种子胚根生长的影响本试验通过研究两种镰刀菌毒素对烟草及其他作物种子胚根生长的作用,证明引起烟草根腐病的镰刀菌产生的毒素是非寄主专化性的,即除了对烟草种子胚根生长具有强烈的抑制作用外,对其他作物如萝卜、白菜种子的胚根生长也有相当的抑制作用。台莲梅曾报道过尖孢镰刀菌产生的毒素对大豆种子胚根的生长有明显的抑制作用,刘梅等在甘蓝的相关研究中也报道其种传尖孢镰刀菌毒素对甘蓝种子的萌发、活力指数等均有明显的抑制作用。本研究中报道的烟草根腐病镰刀菌毒素对烟草种子胚根的生长有明显的抑制作用,这与前人的报道相似。POD、PPO广泛存在于植物体中,在植物遇到逆境时活性较高,能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素,增加木质化的程度来抵御逆境带来的伤害。POD、PPO参与木质素的合成,两者活性还跟酚氧化的量相关,所以被认为是植物防御酶系的主要组成部分。本试验中两种毒素处理幼苗后一段时间内酶活性表现升高,推测毒素激发幼苗体内形成了抗病机制,之后酶活性逐渐降低,说明一段时间后激发的抗性可