烟草赤星病苗期接种方法研究

烟草赤星病苗期接种方法研究

植物病原体的人工再生是研究疾病、感染过程、发病机制、品种抗病性和疾病控制技术等关键疾病的必要试验手段。有关烟草赤星病菌的人工接种方法,文献报道有菌丝块接种、孢子喷雾接种、孢子悬滴接种和孢子悬浮液棉球接种等4种。作者在烟草赤星病菌的有关试验中发现,烟草赤星病菌在烟草苗期接种比较困难,而且不同接种方法的接种结果往往相差较大,这种情况严重影响试验结果的准确性和研究资料的可比性。鉴于上述情况,作者以红花大金元(简称红大)和K326为供试烟草品种,以烟草赤星病菌强致病力菌株GY-31为供试菌株,在温室盆栽条件下,对菌丝块接种、孢子喷雾接种、孢子液棉球接种、孢子悬滴接种和菌丝悬滴接种等5种接种方法的接种效果进行了比较试验,旨在筛选并建立一个适于苗期采用的烟草赤星病接种方法。1材料和方法1.1lterana菌株gy-33菌株的鉴定烟草赤星病菌(Alternariaalterana)菌株GY-31由安徽农业大学植物病原真菌学研究室提供,系从安徽涡阳烟草赤星病病叶组织上分离鉴定获得。1.2燕麦麦片的制备燕麦片培养基(OMA)配制参照方中达的方法,略有改动。取30g燕麦片加入少量水煮沸15min,4层纱布过滤,滤液定容至1000mL,加入20g琼脂加热,待完全溶解后于高压蒸汽灭菌锅内121℃灭菌30min。1.3烟草种子种苗的放养烟草品种K326和红大种子均由云南省烟科研所惠赠。两品种烟草种子在无菌土中发芽1周后,将其幼苗移栽至含有复合肥的无菌土中,在18～20℃的温室中培养至7叶期,用于接种试验。1.4不同的接种方法的比较1.4.1处理配置(1)菌碟的制备将供试烟草赤星病菌在OMA平板上光照培养7d,沿菌落边缘用直径为4mm的打孔器打取菌碟,均匀地放置在烟草最下部2片叶的脉间叶肉上,每片叶上放5块菌碟,并在菌碟上覆盖用灭菌水浸湿的脱脂棉保湿。(2)培养液液细供试烟草赤星病菌在OMA平板上光照培养40d后,用灭菌水洗下,4层纱布过滤,取滤液用灭菌水将孢子浓度稀释至106个·mL-1;将制备好的106个·mL-1孢子悬浮液用小型喷雾器均匀地喷洒在烟草最下部2片叶片上。(3)赤星病菌细胞悬浮液的制备取脱脂棉制作小棉球,浸泡在106个·mL-1的赤星病菌孢子悬浮液中,2min后取出棉球均匀地贴在烟草最下部2叶片的脉间叶肉上,每片叶上放置5个棉球。(4)菌悬滴菌注射将制备好的106个·mL-1的赤星病菌孢子悬浮液用吸管均匀地悬滴在烟草最下部2片叶的脉间叶肉上,每片叶上滴5滴悬浮液。(5)烟苗叶片悬浮液的制备供试烟草赤星病菌在OMA平板上光照培养7d后,每皿加入20mL灭菌水洗下全部菌落,4层纱布过滤,去滤液,取菌丝体加入20mL灭菌水,在匀浆机中5000r·min-1匀浆5min,即得到菌丝片段悬浮液。将制备好的菌丝悬浮液用吸管均匀地悬滴在烟草最下部2片叶的脉间叶肉上,每片叶上滴5滴悬浮液。每个处理接种10株烟苗,3次重复。处理后,保持室温在25～28℃之间,相对湿度大于90%。1.4.2病斑直径、叶片及病叶率接种赤星病菌11d后,调查烟苗发病情况,记载病叶数、叶片病斑直径,计算各处理平均病斑直径和病叶率。采用SAS统计软件对病斑直径数据进行方差分析,多重比较采用Duncan′s新复极差检验(LSRtest)。1.5棉球接种法接种法采用两因素随机区组设计。分别用浓度为104、105和106个·mL-1的孢子悬浮液以孢子液棉球接种法接种红大烟苗,每个浓度处理接20株,分为保湿和不保湿组(每组10株),保湿组烟苗于接种后48h内每4h喷1次灭菌水,不保湿组不作此处理,3次重复。接种后,保持温室内温度在25～28℃之间,相对湿度大于90%。病情调查与数据分析同1.4.2节。2结果与分析2.15种植赤霉病的方法2.1.1不同接种法产生的病斑直径接种赤星病菌11d后对5种接种方法的接种结果进行了调查(表1),结果表明,在烟草品种红大上,5种接种方法接种后所致的病斑直径以菌丝悬滴接种最大,可以导致接种叶片迅速大面积枯萎;其次为孢子液棉球接种、孢子喷雾接种和菌丝块接种,孢子悬滴接种几乎不发病,所致的平均病斑直径仅达1mm。从接种后所引起的病叶率来看,菌丝块接种法最高,为88.67%,其次为孢子液棉球接种法(67.00%);孢子喷雾接种法所致病叶率较低为22.33%,孢子悬滴接种法所致病叶率最低,仅为5.67%。2.1.2引起病害的病斑直径从表2可以看出,在烟草品种K326上接种赤星病菌11d后,5种接种方法中,只有孢子液棉球接种和菌丝块接种引致发病,所致的病斑直径分别为5.73mm和5.23mm;其他3种方法(孢子喷雾接种,孢子悬滴接种和菌丝悬滴接种)未能引起烟苗叶片发病。从接种后所引起的病叶率来看,菌丝块接种法最高,为100%,其次为孢子液棉球接种法(72.33%)。2.1.3球、真菌接种法对5种接种方法在红大和K326这2个烟草品种烟苗上接种赤星病菌的结果进行综合分析认为,孢子液棉球接种法和菌丝块接种法接种成功率较高,所致病害严重度适中,便于考察;同时重复性较好,可以用于烟草赤星病菌的接种;孢子喷雾接种法和孢子悬滴接种法在2个供试品种上接种成功率均很低,菌丝悬滴接种法在红大上引致叶片枯萎,在K326上未引起发病,重复性差,均不适合于烟草赤星病苗期接种。2.2供试培养浓度对接种所致病叶率的影响在不同接种方法比较的基础上,进一步研究了孢子悬浮液浓度和湿度对孢子液棉球接种法接种效果的影响。结果显示,在供试孢子悬浮液浓度范围内,接种所致病叶率随着孢子悬浮液浓度的增大而提高;悬浮液浓度低于104个·mL-1,接种所致病叶率低于35%;悬浮液浓度为105～107个·mL-1,接种所致病叶率为70%～92%(图1)。图1还表明,接种后保湿能显著提高接种所致病叶率。3烟草赤星病育苗接种方法的确定由于烟草赤星病菌属于弱寄生菌,一般只能侵染烟株中下部老黄叶片或成熟叶片,上部幼叶一般不易侵染,因而生产上对于该病的人工接种,一般多在烟草生长中后期(烟叶成熟期)采用孢子悬浮液喷雾法或孢子悬滴法接种。然而,在烟草苗期,上述方法接种成功率低,重复性差。而与成熟期相比,苗期开展烟草试验具有周期短占地小的优势。因此,有必要寻求有效的烟草赤星病菌苗期接种方法。本研究以红大和K326为供试烟草品种,以烟草赤星病菌强致病力菌株GY-31为供试菌株,采用菌丝块接种、孢子喷雾接种、孢子悬浮液棉球接种、孢子悬滴接种、菌丝悬浮液接种等5种方法接种烟草幼苗,结果发现,孢子液棉球接种和菌丝块接种在2个烟草品种上都能引致发病,接种成功率较高,所致病害严重度适中,便于考察,同时重复性较好,可以用于烟草赤星病菌的接种。孢子喷雾接种法和孢子悬滴接种法在2个供试品种上接种成功率均很低,菌丝悬滴接种法在红大上引致叶片枯萎,在K3