生防菌对烟苗生长、诱导抗性和黑胫病的协同增效作用

生防菌对烟苗生长、诱导抗性和黑胫病的协同增效作用

由于抗药性药物的长期、过度或不当，以及药物的抗药性、延展性和农药残留，已成为制约农业生产可持续发展的瓶颈。因此，在监测病虫害、药物等方面的措施尤其重要。赵淑丽等从土壤中选择了放线菌bz45。这不仅对八个致病性的生防菌因素（如玉米诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺基诺卡因的影响，以及对大多数植物硝基诺。1材料和方法1.1菌株制备和苗木制备供试烤烟(Nicotianatabacum)品种为K326,种子由玉溪中烟种子有限责任公司提供.供试生防菌包括长柄木霉ACCC30150和泾阳链霉菌ACCC40021;烟草黑胫病、猝倒病和赤星病病原菌分别为:烟草疫霉(Phytophthoranicotianae)ACCC38065、瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)ACCC38064和链格孢(Alternariaalternata)ACCC38066,以上菌株均由中国农业微生物菌种保藏管理中心提供.取用燕麦培养基培养好的有烟草黑胫病病原菌孢子的培养皿,用接种环刮取孢子,加入20mL无菌水,并加入1mL的1%吐温80,将孢子悬液倾入装有石英砂玻璃珠的孢子分散瓶内,振荡20~30min.将孢子悬液经过灭菌的纱布过滤,用血球计数板测定孢子数,用无菌水将滤液调至105~106cfu·mL-1备用.泾阳链霉菌和长柄木霉孢子悬浮液的制备同上,孢子液浓度为108~109cfu·mL-1.漂浮育苗所用的基质购置于中国农业科学院花卉市场,草炭:珍珠岩:蛭石体积比为75∶15∶15,将各种育苗材料混合均匀后置于121℃下高压灭菌2h后备用.烟草专用育苗肥(四川金叶化肥有限公司生产)养分含量为N∶P2O5∶K2O=19∶10∶20,硝态氮占总氮的60%.育苗池规格为35cm(长)×28cm(宽)×20cm(高),漂浮盘规格为33cm(长)×26cm(宽)×6.5cm(高),70孔.1.2试验设计1.2.1对菌株的容忍度1.2.2心1.5cm处对峙培养法:参照EL-Tarabily等的方法,将各供试病原菌和生防菌置于25℃黑暗条件下培养3d后,在超净工作台上用无菌打孔器(5mm)沿其菌落边缘打菌饼,将长柄木霉分别与烟草黑胫病、猝倒病和赤星病病原菌菌饼接种于PDA培养基上距中心1.5cm处同一直线上的两点上;在PDA和高氏一号等体积混合培养基上选取两点划线接种泾阳链霉菌,在距离平行线等距离处接种烟草病原菌菌饼;同时以只接病原菌和生防菌的培养基作为对照,每处理重复3次,28℃条件下倒置恒温培养,3d后观察记录.菌丝生长抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100%.牛津杯法:将长柄木霉和泾阳链霉菌分别接种在PDA液体培养基和高氏一号液体培养基中培养2~3d(190r·min-1,28℃)制成发酵液备用.将培养好的烟草病原菌制成孢子浓度为1×106cfu·mL-1的菌悬液,取病原菌菌悬液0.1mL涂于PDA平板上,然后在每个培养皿正中央摆放1个牛津杯,向其中加入0.2mL的生防菌发酵液,每个处理重复3次,28℃培养,每24h观察记录抑菌圈半径.1.2.3阳链霉菌的检测试验于2012年2—5月在中国农业科学院农业资源与农业区划研究所日光温室进行.试验设5个处理:对照:无菌水;T0:单接烟草黑胫病菌;T1:单接长柄木霉;T2:单接泾阳链霉菌;T3:混接长柄木霉和泾阳链霉菌.生防菌接种:将制备好的孢子液与适量育苗基质混匀,使育苗基质中孢子含量为3×108cfu·g-1,其中混合接种处理T3中泾阳链霉菌与长柄木霉孢子量各占一半,为1.5×108cfu·g-1,对照和T0用等量无菌水代替生防菌液.病原菌接种:在烟苗生出第6片真叶时采用根基浇灌接种烟草黑胫病菌菌液,接种量为每穴5mL,孢子液浓度为3×105cfu·mL-1,对照用等量无菌水代替病原菌液.每个育苗盘(70株)为1个重复,每处理重复3次.1.3测量设计和方法1.3.1根系形态参数的测定,能够反映根系区域在播种5d后开始调查各处理的出苗率及其生育期;成苗后每个处理随机选取生长整齐且有代表性的10株烟苗,分别测定茎高、有效叶片数、最大叶长、最大叶宽、茎围、地上部和地下部的干质量和鲜质量,具体参照《烟草农艺性状调查方法》(YC/T142—1998).采用根系扫描仪(EpsonPerfectionV700PHOTO)扫描根系样品获取数字化图像,利用根系分析系统软件WinRHI-ZOV2008a(RegentInstrumentInc.,Canada)进行分析,获得根系形态参数,包括总根长、根系总表面积、根系体积和根系平均直径及直径分别为≤0.2mm(细根)、0.2~0.6mm(中等根)和>0.6mm(粗根)范围内的根系长度.1.3.2超氧化物歧化酶活性测定从每个处理样品中随机选取有代表性的烟苗根系,取白色根系0.5g放入预冷的研钵中或加入液氮研磨,期间加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)0.1g,将研磨好的样品转入10mL离心管,加入4℃预冷的提取液5mL,10000r·min-1离心30min,弃沉淀,取上清用于超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化氢酶(CAT)活性测定.其中:SOD活性测定采用氮蓝四唑法;POD活性测定采用愈创木酚比色法;PAL活性测定参照薛应龙等的方法;CAT活性测定参照Cakmak等的方法.1.3.3病情指数计算接种黑胫病菌后至烟苗成苗期间每隔3d调查一次黑胫病发生情况,病害分级按照烟草病害分级调查方法,并计算发病率、病情指数和相对防治效果.发病率=发病株数/调查总株数×100%病情指数=[∑(各级病株或叶数×该病级值)]/(调查总株数或叶数×最高级值)×100相对防治效果=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100%1.4数据处理与分析数据经Excel2007整理后,采用SAS9.0进行方差分析,采用Duncan新复极差方法检验不同处理之间的差异显著性(α=0.05),绘图由Excel2007完成.2结果与分析2.1长柄木霉菌丝生长采用混合培养和牛津杯法测定两菌株相容性,72h后观察两株菌的生长及其互作情况,结果见图1.从混合培养结果来看,在整个生长过程中两株菌未出现相互拮抗作用.具体表现为泾阳链霉菌菌丝正常生长、产孢;长柄木霉菌丝生长迅速,培养3d后菌丝由白色变为黄绿色,随后开始大量产孢;两株菌接触部分菌丝正常生长,并且在此部分长柄木霉孢子量有所增加.从牛津杯测定结果来看,牛津杯内泾阳链霉菌发酵液对其周围长柄木霉无抑制作用,且长柄木霉产孢量有所增加.总之,通过比较分析混合培养和发酵液测定两株菌的生长情况,确定了两株菌不管是菌体本身还是发酵液与菌株之间均无拮抗作用,说明两株生防菌具有较好的亲和性,可以进行组合.2.2对烟草病原菌抑菌活性为了进一步确定两菌株抑菌效果,采用平板对峙培养和牛津杯法测定两株菌对3种烟草病原菌的抑菌作用.从表1可以看出,两菌株在对峙培养时均能不同程度地抑制3种烟草病菌菌丝生长,长柄木霉对土传黑胫病菌抑菌活性较强,泾阳链霉菌则对土传猝倒病菌抑菌活性较强,两菌株对叶部烟草赤星病菌抑菌活性相当.牛津杯法测定发现,泾阳链霉菌发酵液抑菌活性总体大于长柄木霉,两菌株发酵液对3种病原菌的抑菌活性变化规律与对峙培养时抑菌活性表现基本相同.说明两菌株本身及其代谢产物对土壤和叶部不同生境下的病原菌均具有较强的抑菌活性和较广的抑菌谱.2.3不同接种方式对烟草出苗率的影响于播种后观察记录出苗率和烟苗进入各生育期的时间.从表2可以看出,不同生防菌处理与对照相比对出苗率和生育进程有一定影响.接种长柄木霉显著降低了烟草出苗率,单接泾阳链霉菌和混合接种处理均显著提高了烟草出苗率,其中单接泾阳链霉菌处理的出苗率高于混合接种.对烟苗生育进程而言,与对照相比,混合接种和单接泾阳链霉菌的出苗期均提前1d,单接长柄木霉出苗期推迟2d;混合接种和单接泾阳链霉菌的烟苗前期生长速度较快,前期生育期时间缩短,随着烟苗生长的延续,生育期时间的差异逐渐增大,成苗时间最多缩短了4d,而单接长柄木霉其他生长阶段与对照相比均有所推迟,最后成苗时间推迟了4d.由此可知,接种生防菌通过抑制或促进种子萌发影响烟苗出苗率和出苗期,并进一步影响烟苗整个生育进程.2.4生殖器菌对烟苗植物学特性和生物量的影响2.4.1不同接种长柄木霉与对照生长曲线于成苗时测定烟苗的茎高、茎围、叶长和叶片数等烟苗地上部植物学性状.从表3可以看出,单接泾阳链霉菌和混合接种对烟苗茎部、叶部生长和叶片发育均有促进作用,但前者效果不如后者,而接种长柄木霉与对照相比无明显的促进作用.与对照相比,混合接种的茎高和茎围分别提高16.0%和17.0%,叶长、叶宽和叶片数分别提高28.0%、15.0%和19.0%,且均存在显著差异;单接泾阳链霉菌各项生长指标均显著高于对照,单接长柄木霉与对照无显著差异.从茎部和叶部增加的比例来看,单接泾阳链霉菌和混合接种烟苗横向和纵向生长平衡性好,有利于烟苗移栽后茎基部萌发形成大量不定根系,加快烟苗的分化与发育速度.表明单接泾阳链霉菌和混合接种有利于提高烟苗茎部、叶部素质.2.4.2生防菌对烟苗生长和直径的影响培育健壮烟苗是烟草生产的首要环节,而发达的根系是壮苗的标准之一.从表4可以看出,生防菌接种能够促进烟苗的根系生长,增加总表面积和体积并促进根系横向增粗和纵向伸长.单接链霉菌和混合接种烟苗根系体积和总表面积均显著增加,而单接木霉与对照无显著差异;单接长柄木霉、单接泾阳链霉菌和混合接种的总根长分别提高20.0%、74.0%和161.0%,显著高于对照;接种生防菌的处理根系平均直径均显著高于对照.表明生防菌对烟苗的促生作用主要是通过增加根系长度和根系直径来实现的,这也提高了烟苗的总吸收面积和根系活跃吸收面积,优化了根系的表面特性,促进了烟苗地下部的生长发育和形态建成,将缩短移栽后的缓苗期.不同直径范围的根系,其吸收能力存在差别,一般认为细根的吸收能力强于粗根.本研究将不同直径范围根系的长度进行了分析.从表5可知,生防菌能显著增加中等根和细根的长度及其在总根长中的比例;促进侧根(细根和中等根)发育,并进一步促进根系的横向生长,从而增加粗根的长度.与对照相比,接种生防菌在直径≤0.2mm的细根长度均显著增加,此部分根系长度占总根长比例最高;单接泾阳链霉菌和混合接种显著增加了直径在0.2~0.6mm的中等根长度在总根长中所占比例,单接长柄木霉与对照无显著差异;混合接种下直径>0.6mm粗根长度显著增加,但效果不如单接泾阳链霉菌,而接种长柄木霉抑制了粗根的生长.可见,混合接种对细根和中等根长度的促进作用明显,有利于增大中等根的分配比例,这将增强根部对养分的吸收和运输能力,协调地下部与地上部的生长.2.4.3接种生防菌干鲜比和根冠比烟苗的生物量和根冠比是衡量壮苗的重要指标,为了更全面地评估生防菌的促生效果,于成苗时测定了烟苗地下部和地上部烟苗鲜质量和干质量,计算了根冠比和干鲜比,结果见表6.就鲜质量而言,混合接种显著增加了地上部鲜质量,单接生防菌处理烟苗地上部鲜质量差异不明显,接种生防菌根系鲜质量显著高于对照.在干物质积累量方面,单接泾阳链霉菌和混合接种地上部干质量显著增加,而单接长柄木霉与对照无显著差异,但接种生防菌地下部根系干物质量均显著高于对照.就根冠比和干鲜比来看,接种生防菌干鲜比和根冠比均高于对照,且根冠比均大于0.2,符合烟草壮苗的标准.2.5生育菌对烟苗抗性的影响2.5.1sod、pod和pal活性防御酶活性是表征植株抗病性强弱的主要参数,能够反映生防菌诱导烟苗抗性的能力.于成苗时测定了各处理的防御酶活性,结果见图2.生防菌处理烟苗后防御酶(SOD、POD、CAT和PAL)活性均显著增加.SOD活性除单接长柄木霉与对照无显著差异外,其余处理均存在显著差异,混合接种比对照提高70%;混合接种比对照的POD、CAT和PAL活性分别提高40%、92%和104.0%,均存在显著差异;混合接种与单接长柄木霉的SOD和POD活性无显著差异,而PAL和CAT活性存在显著差异,但4种酶活性均显著高于单接泾阳链霉菌处理.可见,生防菌组合能够诱导烟苗的信号系统,启动植株体内防御酶系的表达,表明生防菌能够增强烟苗抗病性潜力,但不同生防菌处理酶表达量存在差异.2.5.2不同接长柄木霉防效接种生防菌后每天观察记录烟苗病害发生情况.从表7可以看出,接种生防菌显著降低了烟草黑胫病发病率和病情指数,提高了防治效果.各处理中混合接种的防效最好,为69.3%,单接长柄木霉优于单接泾阳链霉菌防效,且存在显著差异.黑胫病发病率和病情指数计算结果显示,生防菌组合的发病率和病情指数分别比对照降低50.7%和52.7%,且均存在显著差异.单接长柄木霉防效好于单接泾阳链霉菌,而长柄木霉与泾阳链霉菌对防治烟草黑胫病是一个增效的组合.3讨论3.1生防菌组合增效机制国内外对生防菌组合的研究主要集中在真菌与真菌、真菌与细菌、细菌与酵母等方面,大多数研究表明生防菌复配可提高生物防治的效果,然而,也有不少报导指出混配制剂并未导致生物防治效果的提高.其中,菌株间的不亲和性是复配不成功的重要原因.本研究针对研究较少的真菌与放线菌复配,利用混合培养法和牛津杯法,测定了两生防菌之间的相互作用,确定了两者是亲和性组合.亲和性是生防菌复配的前提,复配后能不能发挥协同增效作用与菌株自身的抑菌能力、抑菌机制和抑菌谱范围联系密切.本研究以来自土壤和植物叶部两种不同生境和具有不同传播途径的多种病原菌为标靶,分析了两菌株本身及其代谢产物的抑菌活性和抑菌谱.结果表明,泾阳链霉菌发酵液对烟草猝倒病菌抑菌作用较强,而长柄木霉菌丝对烟草黑胫病菌的抑菌作用尤为突出,推测可能与泾阳链霉菌产抗生素和长柄木霉具有多种拮抗作用机制有关.虽然这些存在不同作用机制且具有亲和性的生防菌组合能拓宽抑菌谱,但这并不意味着组合的结果一定是增效.在田间环境下多菌协同防病更不是简单的加性效应,生防菌复配时还必须考虑作物的生境、防治的对象和传播途径等多方面因素,才能实现生防菌组合增效的目的.3.2生防菌组合的筛选结果目前利用木霉和放线菌作为单一促生菌调节植物生长、改善作物品质和提高产量等方面的研究国内外均有报道.如禚苏等研究发现,适宜浓度的放线菌能促进黄瓜幼苗株高和根的生长,提高叶片叶绿素含量.Hexon等用绿木霉(Trichodermavirens)次生代谢产物处理拟南芥使其鲜质量增加了62%.但Martínez-Medina等认为,与单一促生菌相比,菌株间组合在促进植物生长方面有更好的表现.本研究表明,长柄木霉与泾阳链霉菌单接和混接均能不同程度地促进烟苗地上和地下部分的生长,混合接种的促生效应优于单独接种.该结果与Cassán等和Khaled的结果一致.本研究发现,接种泾阳链霉菌对烟苗纵向(茎高、叶长、根长)和横向(茎围、叶宽、根平均直径)方面具有促生和协调物质分配作用,尤其是烟苗根系和茎平均直径的增加可保证其营养物质和水分运输,从而协调地下部和地上部生长.分析原因可能是泾阳链霉菌分泌的激素、有机酸、维生素等次生代谢产物能促使植物细胞的分裂和伸长的缘故.然而,本研究仅从宏观上对生防菌组合的综合特性进行评价,所涉及的接种材料还比较单一,对于多菌混合菌群的复配、各生防菌在组合防病促生中的微观追踪和动态变化以及生防菌-病原菌-寄主植物三者的互作关系还有待进一步研究.3.3生防菌对烟苗的作诱导国内外均有利用多菌组合防治植物病害的报道,且已证实多菌组合能够影响防效,但并非所有组合均能提高防效.本研究发现,接种长柄木霉后表现出较强竞争优势,在育苗盘上生长迅速,生长前期对烟草种子的萌发有一定影响,而后在烟草根部定殖后,优先占领基质,有