银杏叶总黄酮提取工艺的优化

银杏叶总黄酮提取工艺的优化

银杏是原产于中国的一种地球追踪植物。它是一种地球追踪植物，存在于浙江省山脚、大理山等地。由于它基本保持了1.5亿年前的生态特征,又称“活化石”植物。银杏叶提取物(GBE)的主要成分是黄酮类化合物,不但有扩张血管的作用,从而增加心脑血液流量,还有抗炎、镇痛、抗衰老、降血脂、抗肿瘤、抗白血病、调节内分泌等功能,可用于治疗由于血管老化、脑血管供血不足所导致的外周循环不良、眩晕、耳鸣、头痛、失眠、短期性记忆不良、听力障碍、精神不振等。鉴于银杏黄酮具有独特的生理作用、临床治疗和保健价值,使GBE及其制剂成为近年来国际国内研究开发的热点之一,不断探索新的提取工艺及新的测定方法已成值得关注的问题。银杏叶中有效成分的提取常用乙醇、水等溶剂,不同溶剂对银杏叶中有效成分的提取有较大影响。乙醇提取效率高,但成本也较高,且产品成分较杂;水浸提法成本较低,但提取效率也低。近年来,超声技术应用于提取植物中的生物碱、苷类、生物活性物质、动物组织浆的毒质等研究已有报道,表明其具有能耗低、效率高、不破坏有效成分的特点。超声波应用于银杏中黄酮的提取主要是利用其空化作用,即一定频率的超声波作用于溶液时,液体中尺寸适宜的小气泡发生共振现象,强烈的冲击波使细胞壁破裂,有效成分溶出,且体系的温度不会大幅升高,不会破坏有效成分。因此超声波提取银杏叶黄酮具优越性,可以强化浸提,达到省时、高效、节能的目的,将其应用于银杏黄酮提取纯化工艺中必将促进银杏叶开发产业的发展,具有广阔的应用前景。有关GBE的提取工艺方法已有较多报道,本实验结合生产实际,采用正交实验设计法对银杏总黄酮的粗提工艺做了筛选,以求得到质量高和收率稳定的产品。同时,由于各种浸提方法得到的中药浸提液往往含有多种成分及混有沉淀物、泥沙等固体杂质,为了去除杂质,提高有效成分含量,增加制剂的稳定性,必须对浸提液进一步分离和精制,这也是改变传统中药制剂“粗、大、黑”的关键。絮凝澄清法是在中药提取液或提取浓缩液中加入一种澄清剂以吸附架桥和电中和方式除去溶液中的粗粒子,以达分离纯化目的的一种方法,近年来逐渐受到人们的重视。絮凝剂的种类很多,有明胶、蛋清、101果汁澄清剂、ZTC1+1澄清剂、壳聚糖等。本文将对ZTC1+1澄清剂在银杏叶总黄酮提取中的应用作一些探讨。此外,微波辅助提取法也是一种有效的提取方法,微波萃取方法具有方便、快速和可用水作萃取溶剂的优点。虽然微波萃取土壤中的有机污染化合物已有标准方法EPA3546,但就目前而言,微波萃取的应用对象还较少,其应用研究还处于初始阶段,它是一种新的样品处理方法。本文对比研究了微波辅助提取法与超声法,以寻找提取银杏叶总黄酮的最佳工艺。1材料和方法1.1硝酸钠、硝酸盐铝、对酸钠的澄清样品:银杏叶于2004年12月采于西南师范大学校园内,洗净,烘干,粉碎,保存备用。试剂:芦丁标准品(中国药品生物制品检定所)、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、95%乙醇;澄清剂ZTC1+1(天津正天成澄清技术有限公司)。仪器:WFJ型7200可见分光光度计(尤尼柯仪器有限公司)、TD25-WS多管架自动平衡器(长沙湘仪离心机有限公司)、THZ-C恒温振荡器(江苏太仓市试验设备厂)、KQ5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、SHZ-D循环水式真空泵(巩义市英峡予华仪器厂)、PJ17F-F(Q)美的微波炉。1.2黄酮的总测定1.2.1芦丁显色反应的稳定性取95%的乙醇配制0.4mg/mL芦丁标准品1.0mL,加入2mL水、5%NaNO20.3mL,摇匀,放置6min后加入10%Al(NO3)30.3mL,6min后再加入1mol/LNaOH4mL混匀,用水定容至10mL,10min后,在UV240型紫外-可见分光光度计(日本岛津)上从波长300nm到700nm进行扫描,结果表明:芦丁显色反应后在508nm处有最大吸收峰。1.2.2标准曲线的制备银杏叶提取物中黄酮类化合物的含量测定采用分光光度法。以芦丁为标准品,用95%乙醇准确配制芦丁浓度为1.0mg/mL的溶液。分别准确吸取该芦丁标准溶液0.0、0.5、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5mL,用蒸馏水定容至3mL,分别得到浓度为0.000、0.167、0.333、0.5、0.667、0.833mg/mL的标准溶液。各浓度标准溶液均取1mL,各加入2mL水、5%NaNO20.3mL,摇匀,放置6min后加入10%Al(NO3)30.3mL,6min后再加入1mol/LNaOH4mL混匀,用水定容至10mL,10min后,以芦丁含量为0.000mg/mL的标准溶液为参比,在波长508nm处测定吸光度。各样品中总黄酮浓度按上述方法测定吸光度后由线性回归方程计算得到。1.2.3总黄酮含量测定取一定量样品置于称量瓶中,于80℃下烘至恒质量,得到干物质量,另测定总黄酮浓度,计算得到总黄酮量。总黄酮纯度=总黄酮量(mg)/干物质量(mg)×100%黄酮回收率=样品中总黄酮量(mg)/叶片中总黄酮量(mg)×100%1.3超声辅助提取法参考有关文献并结合实际情况,以提取溶剂系统即乙醇浓度(B)、各溶剂系统的浸泡时间(A)、超声波处理时间(C)为影响提取物总黄酮含量的主要因素,每个因素取3个水平(见表1)。选用L9(33)正交试验表安排试验,共9组,每组3次平行实验,其中超声波处理时温度为25℃,功率100W。精确称取银杏叶干粉10g,加入不同溶剂系统,平行操作条件下,在恒温摇床上浸泡提取,温度为30℃。减压抽滤后,稀释5倍后测定计算总黄酮含量。1.4预处理提取液的制备取澄清剂ZTC1+1的A组分加入蒸馏水配成0.25%的溶液预处理剂A80mL,取澄清剂ZTC1+1的B组分加入0.5%的醋酸配成0.5%浓度的溶液预处理剂B80mL备用。取170mL银杏黄酮提取液于大烧杯中,加入预处理剂B4.5mL,在温度为50～80℃的水浴中加热2h,每30min搅拌一次.然后加入预处理剂A2.5mL,不需水浴加热,30～60min后搅拌一次,2h后3600r/min离心20min,上清液即为预处理的提取液。稀释5倍后,测其OD值,计算黄酮含量,并与同等条件下,未经澄清剂处理过的提取液进行纯度和回收率的比较。1.5微波提取精确称量6g银杏粉,用120mL去离子水浸泡24h后,用微波提取,在中低火条件下,提取时间分别是:3、5、8min,用纱布过滤掉渣滓,减压抽滤后,将上清液稀释5倍,测其OD值,并计算得率。2结果与分析2.1回归方程的建立采用二元线性回归法得到以下吸光度(x)与芦丁浓度(y)之间的回归方程(ORIGIN软件处理):y=1.38046x+0.05874,相关系数r=0.99698,标准曲线见图1。2.2正交试验的结果和分布分析2.2.1因素的主次顺序由表2可以看出,因素B(溶剂系统)的极差R(1.388)最大,这说明因素B的水平改变对实验指标的影响最大。因素A的R值次之,因素C的R值最小,因此根据R值的大小可知,3个因素的主次顺序为B>A>C。从图2～4中直观可见,吸光度越大,提取总黄酮的效果越佳,因此本正交试验最优组合为A2B2C3,即银杏叶总黄酮最佳提取工艺条件为:溶剂系统60%乙醇,提取时间10h,超声波处理时间25min。2.2.2提取影响顺序从吸光度这一指标来看,发现溶剂系统这一因素对其有极显著影响,PB<0.01,而浸泡时间与超声时间均为不显著影响因素,PA>0.05,PC>0.05,因此,3个因素对提取影响顺序为:B>A>C(表3)。2.3黄酮的回收率表4说明,用ZTC1+1天然澄清剂除杂,虽然回收率减低了25.81个百分点,但使银杏叶黄酮的纯度提高了7.13个百分点,从而提高了产品的内在质量,增加了制剂的稳定性,有广泛的应用前景。2.4酮含量测定微波处理结果表明,微波提取时间以8min效果最好,总黄酮含量达27.33mg/g,而微波提取5、3min所得总黄酮含量分别只有25.33、21.33mg/g。由图5可知,银杏黄酮的各提取条件效果依次为:微波水提取>超声乙醇提取>超声水提取,其中超声提取时,水提的黄酮含量很低,而且过滤时非常困难,说明提取液中无效成分(如糖、淀粉)较多,而60%乙醇提取的黄酮含量高、杂质少,说明乙醇的提取效果大大优于水,而超声提取与微波提取相比,微波提取的效果更佳。3超声时间、条件、提取通过正交试验的极差分析以及方差分析可以看出:各因素对实验指标(吸光度)的影响按大小次序排列为B(溶剂系统)>A(浸泡时间)>C(超声时间),最好的提取方案应当是:溶剂系统60%乙醇,浸泡时间10h,超声时间25min。因此,在进行银杏黄酮提取时,要特别强调溶剂系统的浓度,浸泡时间和超声时间对提取效果的影响不显著,从节省能源考虑,超声波提取5～15min也是可以的。天然澄清剂的使用,不仅解决了澄清度问题,具有高效、简便、成本低、稳定强的优点,而且对有效成分无明显影响,有较好的应用前景,值得推广。微波萃取具有快速、低溶剂消耗、污染小、萃取效率高等优点。但到目前为止,由于其提取量少,它主要还是作为一种分析试样预处理的手段和一种提取精油等有用物质的方法,其研究还处