绿色木霉菌v-1菌株在烟草三叶定殖中的生长

绿色木霉菌v-1菌株在烟草三叶定殖中的生长

草木菌剂是由土壤中诱导得到的绿色木菌（tt-1）开发的微生物杀菌剂。具有广的光谱抗菌性和抗菌活性。它对主要真菌疾病（如黑草、草赤星病和草猝死等）也有很高的预防效果。在草的生产过程中，木霉素不仅具有上述抗菌作用外，而且对促进烟草素的生长起到了很强的作用。为了进一步研究木霉素的肥效，以及使用后烟草的生理变化，我们研究了木霉素在烟草素中的定位和性质。1材料和方法1.1材料表面1.1.1aviridpers,opfr.Tv-1:绿色木霉(TrichodermaviridPers.ExFr.)。木霉菌剂:颗粒剂有效浓度7×107个孢子/g;粉剂有效浓度3×1010个孢子/g。1.1.2试验草品种K326、G28、NC89、NC82、RG11、云烟851.1.3响应面图木霉半选择性培养基(TSM):MgSO4·7H2O0.2g;K2HPO40.9g;KCl0.25g;NH4NO31.0g;葡萄糖3.0g;氯霉素0.25g;玫瑰红0.15g;敌克松可湿性粉剂0.3g;PCNB0.2g;琼脂20g;H2O1000mL。土壤浸渍液琼胶培养基(SA)的制备:取自然土壤1000g,加水1000mL,浸泡一段时间后双层滤纸过滤,按如下成分配制培养基:土壤浸液100mL;琼脂15g;水900mL。然后分装灭菌。1.2方法1.2.1试验设计与处理盆栽试验:试验设在云南烟草研究院农业所试验基地,装盆土壤为沙壤土,装盆体积24L,品种为K326,用于测定生理生化指标。大田试验:试验设在红塔区北城镇(水稻土)、峨山县小街镇(红壤)、江川县安化乡(紫色土),品种为K326,用于测定大田烟株性状。处理设置:试验从不同营养水平与不同木霉制剂用量水平两方面进行研究,采用裂区试验设计处理。以施肥量(0、4、8gN/株,N∶P2O5∶K2O=1∶1∶2)为主处理,木霉菌剂用量(0、45kg/hm2)为副处理,处理组合见表1。盆栽每个处理栽10盆,田间试验处理随机排列,3次重复,每小区植烟50株以上,栽烟行株1.1m×0.6m。肥料利用率与生理生化测定:在测定生物量和N、P、K含量的基础上,用差减法测定氮、磷、钾肥料利用率。烟叶叶绿体色素、硝酸还原酶(NR)活性和游离脯氨酸(FPro)、丙二醛(MDA)的含量用比色法测定。1.2.2tv-1接种量的测定烟苗的准备:供试烟草种子先经1%的NaClO表面消毒5min,再用灭菌水漂洗3次,然后在灭菌条件下吸胀24h,倒掉灭菌水后再用新灭菌水漂洗3次,取出烟草种子置于经灭菌含湿滤纸上,灭菌条件下风干,催芽3d后播入无菌土中,放入培养箱中培养至5～7叶期移入上述试验土中。叶面接种:用无菌水多次冲洗叶片,将Tv-1摇瓶培养液均匀喷至叶面(叶面叶背均要喷),喷后4h第一次取样,以后每隔7d取一次样。Tv-1叶面定殖动态:PD培养液培养5d的Tv-1菌液,经离心后用无菌水悬浮,调节到108cfu/mL。用经70%酒精消过毒的手持喷雾器喷雾,直到叶面上均匀布满一层细微水珠而不流淌为止。喷雾后1h取第一次样,以后每隔一周取一次样,共4次。每次每处理取的叶片剪成0.5cm小段,无菌水中振荡(120r/分)洗30min。取稀释液涂布于木霉半选择性培养基(TSM)上,28℃下培养10d,5皿重复,计菌落数。以第一次取样所检测到的菌量为接种量。菌量以cfu/g叶表示。电镜样品处理及观察:将所取样品切成小片,于3%戊二醛中固定3h,然后丙酮梯度脱水,醋酸异戊酯置换,二氧化碳临界点干燥,喷金后扫描电镜观察,照相。1.2.3培养条件检查结果烟苗的准备:同一种影响因素试验的不同处理所使用的烟苗均于相同Tv-1孢子含量的悬浮液中浸泡1h。移入不同处理的SA中后,分别于3d,6d,9d时检查结果。检查时,分别称剪取幼根0.01g,研磨成浆状,稀释一定倍数涂于TSM上培养5d后,计菌落数。水分含量测定:将SA分别按琼脂含量为0.5%、1.5%、3%、5.0%、7.0%、9.0%配制。pH值测定:将SA分别配制成pH值为4、5、6、7、8、9。不同培养基测定:将上述烟苗培养于SA、WA(水洋菜平板)、GA(2%葡萄糖洋菜平板)。不同烟草品种准备:分别于SA上培养以上6种不同品种烟苗。2结果和分析2.1木霉剂肥效果2.1.1木霉菌剂的对比试验在玉溪市红塔区北城镇进行了苗期(袋苗)施用木霉菌剂的对比试验,指出木霉菌剂对烤烟袋苗有较好的促生效果。其株高、叶数及叶片长宽比对照增加10%左右,而根、茎、叶比对照增加50%～80%(表2)。2.1.2不同土壤、红土、水土流变对红土促生的影响从表3、表4和表5可以看出,施用木霉菌剂对烟株长势、长相均有一定作用,但在不同土壤上表现有差异,红壤土上的促生作用较大,水稻土和紫色土上的促生效果较小。而且,施用木霉菌剂对烟株上部叶的展开有很好的效果。2.1.3不同施肥水平下木霉菌剂产出量比较田间结果表明,在红壤和水稻土上施用木霉菌剂的增产增值效果较好,而紫色土上效果不明显。方差分析还指出,在同等施肥水平下,施用与不施用木霉菌剂产值量差异不明显。但是,在红壤和水稻土上每hm2施用60kg纯N的条件下,施用45kg木霉菌剂的能明显地使烟叶产量提高8.5%～10.8%,产值提高10.2%,均价和上等烟比例也有不同幅度的增加,而且其产量、产值及外观品质已接近或超过了每hm2施纯N120kg的处理(表6)。2.1.4不同施肥方案对土壤养分利用率的影响从盆栽试验结果中以看出,烤烟施用木霉菌剂后,烟株的干物重、养分(N、P、K)吸收量、肥料与土壤养分利用率均得到了提高。其中,在施用N4g/株的条件下,施木霉菌剂对N、P、K肥利用率的提高幅度最大,与同等施肥水平相比,N、P、K肥利用率分别提高了7.7%、1.13%和11.8%。更为显著的是,施用木霉菌剂能使土壤养分利用率大幅度提高,土壤N、P、K利用率分别提高了21.8%、27.3%、38.5%(表7)。因此,施用木霉菌剂不但能提高肥料利用率,而且对提高土壤养分利用率的使用更大。2.1.5木霉菌剂对低碳烟株氮素的影响叶绿体色素:烟叶在生长发育期间,其叶绿体色素含量与烟株长势、养分协调性有很大关系。从表8看出,在同等施肥水平下,施用木霉菌剂的处理烟叶叶绿体色素含量明显得到提高。更重要的是,施用木霉菌剂后烟叶黄绿比相应提高,说明其成熟与落黄较为协调。硝酸还原酶(NR)活性:硝酸还原酶是植物氮代谢的关键酶,其活力的高低可以反映氮素的供给与还原情况。从图1可以看出,施用木霉菌剂后,烟叶内的NR活性得到了提高,提高幅度为6.7～12.3个百分点。说明施用木霉菌剂可提高烟株的氮素谢代水平,促进烟株对氮素的吸收与利用。游离脯氨酸:游离脯氨酸是植物处于环境胁迫下而产生的一种重要氨基酸。就烟草而言,在烟叶内产生较多的游离脯氨酸一方面可提高抵御能力,但另一方面也是代谢不平衡的表现,对烟叶品质形成不利。烤烟施用木霉菌剂后,可使烟叶内的游离脯氨酸降低,代谢趋于平衡,降低幅度为12.3%～25.6%(图2)。丙二醛(MDA):MDA是植物细胞膜脂过氧化的产物,与植物的抗逆性、衰老等有密切关系。烟草叶片的MDA含量与品种、气候、栽培有关,可作为烟草抗病性与成熟性的重要指标。在本试验的6个处理中,以处理4的烟叶MDA含量最高,比同等施肥量的处理3MDA含量提高了76.6%(图3)。表明施N4g/株与施用木霉菌剂45kg/hm2株的处理烟株抗病性强,成熟落黄较为正常,有利于烟叶品质形成。2.2牧草表面的定殖研究2.2.1tv-1的定殖喷雾后24h取样观察,可以看到Tv-1的分生孢子在叶面上的分布极不均匀,既有散生或几个聚在一起,也有多个聚生,以气孔周围及叶面凹陷处居多(封三图版1)。喷雾后一周取样观察Tv-1在叶面的定殖情况,可以看到Tv-1的菌丝及分生孢子混合存在(封三图版2);定殖的适宜位点在气孔周围及叶面腺毛基部(封三图版3,4)。封三图版5为未喷施Tv-1的对照叶片。在观察的样品中,多数均能看到Tv-1菌丝侵入叶片的生长趋势,侵入位点多位于叶面凹陷处(封三图版6)。2.2.2tv-1分散剂用量Tv-1在叶面上的生长曲线见图4。第一次取样,菌量为2.1×106cfu/g叶片,此即为Tv-1的接种量。一周后第2次检测,数量降为1.3×105cfu/g叶片。Tv-1在室内培养约需4d时间产孢,在叶面环境中由于各种条件的影响,产孢量会受到抑制,产孢时间也要长于室内培养。因此,第一周内的菌量比初始菌量降低。此后Tv-1适应了叶面环境,菌量逐渐回升,第2周检测菌量为3.9×105cfu/g叶片。从第3周开始,菌量持续下降,尤其是第4周内菌量降至1.1×103cfu/g叶片。2.3草本根的边界分布2.3.1tv-1定殖Tv-1菌株定殖烟草根部能力受水分含量影响明显。在3%含水量的SA上,Tv-1定殖数量最高。水分偏高或偏低都影响Tv-1菌株在烟草根部的定殖,且差异达到了显著水平(α=0.05)。2.3.2检查结果的测定Tv-1菌株定殖烟草根部的能力受pH影响较大。第3d、6d、9d3次检查结果均表明。最高定殖量同最低定殖量之间达到显著性差异(α=0.05)。pH4,5,6条件下的定殖量明显高于pH8,9条件下的定殖。表明偏酸性的环境较适合于Tv-1的定殖。2.3.3烟草顶部的定殖生长于GA营养条件下的Tv-1,在烟草根部的定殖数量明显高于WA上的定殖数量,总体水平也要高于SA。差异也达到了显著水平(α=0.05)。2.3.4烟草品种深部定殖在SA平板上培养3,6,9d时,Tv-1菌株在6个烟草品种根部定殖数量变化较大,且定殖数量差异显著(α=0.05)。但从总体上看,云烟85,G28,NC89较适合于Tv-1的定殖。3结论和讨论3.1木霉菌剂促生长作用机制从上述施用木霉菌剂后,对烟苗素质、大田烟株性状、烟叶产质量、肥料利用率和生理代谢的影响等可看出:木霉菌剂能明显改善烟株的农艺性状,提高烟叶产质量,提高肥料利用率以及协调烟株生理代谢平衡。木霉菌剂的促生长作用机制目前认为主要是菌体代谢物中生长素类如赤霉素、吲哚乙酸等的直接作用以及酶类如纤维素酶、几丁质酶等的间接作用。当然这涉及烟株、木霉菌和土壤3方面的因素,在本研究中也发现在不施肥或施肥水平过高的条件下,施用木霉菌剂不能起到增产增值效果,这值得进一步探讨。3.2tv-1位点的优势生防菌在植物表面的定殖能力反映了生防菌在植物表面与病原菌竞争空间和营养的能力。本文研究表明,Tv-1可以在烟草叶面定殖。Tv-1在叶面喷雾后,主要定殖于叶面气孔周围、腺毛基部及叶面凹陷处。这些位点或是分泌物产生处,或是叶面水分分布较多处,能为Tv-1的生长繁殖提供适宜的条件。另一方面,这些位点也是其它病原菌的竞争位点,但Tv-1是人工接种,且生长繁殖速度快,相比病原菌具有种群数量大,出现早的特点。因此,Tv-1对这些位点的抢先占领,不仅有利于本身的生存,而且使烟草叶面受到保护,免于病原菌的侵染。生防菌在植物体内的传导能力也在一定程度上反映了生防菌在植物体内与病原菌竞争空间可营养的能力。Tv-1在烟草叶面上具有强烈的侵入叶片的生长趋势,很可能能够从叶面上的某些适宜位点进入烟株内部生长繁殖。如果Tv-1能够进入烟株内部,其生长繁殖势必受到植物的保护,在竞争压力相对较小的环境中增殖。不仅可以有效的杀伤烟株内部的病原菌,还可以达到长期防治病害的目的。但Tv-1是否具有从叶面进入植株内部生长的能力还需进一步深入研究。3.3tv-1定殖的培养过程偏酸性的环境利于Tv-1的定殖,这与平板培养结果是一致的。平板培养结果表明:绿色木霉菌最适生长pH5.0～5.5,分生孢子的萌发受H+浓度的影响,酸性条件比碱性条件利于萌发。不同品种对Tv-1定殖的影响可能反映了植物生长期间根分泌物质种类与数量的变化。据Darah(1991)研究表明:根圈微生物