转基因烟草幼苗生理高温抗热性研究

转基因烟草幼苗生理高温抗热性研究

根据气候预测，温室效应促进了全球气温的上升，所有植物都面临着高温和其他挑战，植物的抗热性变得越来越重要。在高温胁迫下,植物的器官、组织、细胞、以及细胞内的细胞器结构会发生改变,植株的生理生化过程会受到影响,从而不同程度地影响植物的生长发育。MARTIREAU等指出植物在高温胁迫下的膜伤害与质膜透性的增加是高温伤害的本质之一。由于高温下细胞内的超氧自由基(O-2)、羟自由基(OH-),MDA的产生和消除的平衡受到破坏,而造成O-2,OH-和MDA的积累,引起膜中蛋白质聚合和交联以及膜中脂类的变化,从而直接影响膜的流动性和透性,对植物造成伤害。吴国荣等用生理高温处理佛州侧耳时,发现佛州侧耳呼吸速率增大,吸收O2的速率增加,产生O-2的速率随之同步增加,SOD活性就逐步升高。生理高温是指介于植物生长的最适温度与最高温度之间的高温。持续的生理高温会不同程度地影响生物的生长发育和新陈代谢。烟草(NicotianatobacumL.)起源于热带,是一种很重要的经济作物。烟草属于喜温作物,其一般生长适宜温度为25～28℃,如遇较长时间高温胁迫下,其生长发育会受到不同程度的影响,特别在幼苗生长时期,受到的影响最为明显。提高植物耐热性的方法有多种,其中有效途径之一是培育转基因耐热植物。例如,通过转基因方法,提高植物抗氧化酶(如SOD,CAT)活性,能够有效清除积累的活性氧类物质,从而可能提高植物的抗热性。鉴定植物的耐热性指标有很多种,如形态指标、生长指标、生理生化指标、分子生物学指标等。胡志辉等用种子活力测定、外观形态观察、夏季田间自然鉴定、电导率、叶绿素测定等方法评价辣椒新品种的耐热性。本文以两个转基因烟草品系和一个非转基因品系作为试验材料,用生理高温(38±1)℃处理供试烟草品系幼苗,通过观察和测定有关形态、生理生化指标及生物量,初步评价转基因烟草的抗热性。1材料和方法1.1烟草品系的表达转基因Mn-SOD高表达烟草品系(简称Mn-SOD高)、转基因POD高表达烟草品系(简称POD高)和非转基因烟草对照品系(简称非转基因)。1.2生理生化指标选生长基本一致的盆栽7～8叶龄的烟苗,每个品系30株,分为处理组和对照组。各设5次重复。将处理组幼苗置于恒温箱中,每天10∶00～17∶00控温为(38±1)℃,其余时间让其在自然温度下生长。对照组烟苗在自然条件下生长。分别在高温处理3d(T3)和6d(T6),以及高温处理3d后恢复生长4d(T3-H4)、高温处理6d后恢复生长4d(T6-H4)和高温处理6d后恢复生长8d(T6-H8),取样测定相关生理生化指标。用处理/对照的百分比表示生理高温对供试品系的影响。1.3材料的恢复生长待高温处理3d的材料恢复生长10d(H3-10),高温处理6d的材料恢复生长10d(T6-H10)及高温处理6d的材料恢复生长20d(T6-H20)后,将烟苗连根拔起,洗净泥沙,自然晾干,称重。用处理/对照的百分比表示生理高温对供试品系的影响。1.4电导率的测定用NBT光化还原法测定SOD活性。用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量。用硫代巴比妥酸法测定丙二醛和可溶性糖含量。质膜透性的测定:用打孔器取10个烟叶小圆片(避开大叶脉)于20mL刻度试管中,加入超纯水至刻度处,然后置于真空干燥器中用真空泵分两次共抽气60min,使叶圆片沉于水中。取出摇匀,用电导仪测定其电导率;然后置于沸水中煮15min,自然冷却后加超纯水至刻度,摇匀后测定电导率。用相对电导率(第1次电导率值/第2次电导率值×100%)表示细胞质膜透性的大小。2结果与分析2.1高温处理对烟苗激发叶片的影响生理高温对烟苗叶片都产生了不同程度的伤害。高温处理3d的烟苗基部少数叶片表现出一定程度的萎蔫,伤害较轻。高温处理6d的烟苗基部多数叶片表现出明显萎蔫,部分叶片由绿色变为浅黄色、黄色,甚至有一部分叶片脱落。由此看出,所用生理高温(38±1)℃对烟苗生长有胁迫作用,而且高温处理的时间越长,胁迫作用越明显。2.2在烟苗生理高温处理后生长情况据图1可知,生理高温处理时间越长,烟苗生长受到的伤害越大,恢复正常生长需要的时间越长。例如,POD高T3-H10为97.47%,T6-H10为72.73%。由此可见,与生理高温处理6d的烟苗相比,生理高温处理3d的烟苗更容易恢复正常生长。比较生理高温处理后的烟苗恢复生长情况,发现3个供试烟草品系恢复生长的速度由大到小排列为:POD高>Mn-SOD高>非转基因。例如,POD高T6-H10为72.73%,Mn-SOD高T6-H10为65.93%,非转基因T6-H10为56.69%。这表明生理高温对转基因烟草品系幼苗影响相对较小,其中POD高品系幼苗受到的影响最小。2.3烟苗的质膜透性生理高温处理期间的烟草幼苗,其细胞质膜透性(相对电导率)均降低。处理6d后的烟苗,在恢复生长初期,其质膜透性均升高;随恢复生长时间延长,质膜透性均降低。这表明生理高温对烟苗细胞的伤害是一种渐变的量变过程。生理高温处理6d,恢复生长4d的烟苗质膜透性,非转基因升高34.42%,Mn-SOD高升高23.21%,POD高升高17.08%(图2)。由此可见,转基因烟草品系幼苗的耐热性比非转基因品系强。2.4烟草品系叶片mda含量的变化生理高温处理可引起烟草幼苗叶片丙二醛(MDA)的含量升高。生理高温处理的时间越长,供试烟草品系叶片的丙二醛(MDA)的含量越高。例如,非转基因品系的MDA含量,T3升高21.1%,T6升高70.84%。在恢复生长期间,各供试品系烟苗叶片的MDA含量都下降。生理高温处理第6d,3个烟草品系幼苗叶片MDA含量的升高值由大到小依次是:非转基因>Mn-SOD高>POD高(图3)。这说明转基因烟草品系幼苗的耐热性比非转基因品系更强。2.5叶片可溶性糖含量从图4可以看到,生理高温处理引起烟草幼苗叶片可溶性糖含量升高。处理时间越长,叶片可溶性糖含量越高,其中非转基因品系上升最快,SOD高品系其次,POD高品系上升最慢。恢复生长期间,3个品系的可溶性糖含量都下降,随着恢复生长时间的延长,可溶性糖含量可能恢复到正常水平。2.6烟草幼苗叶片sod活性的变化生理高温处理引起转基因烟草幼苗叶片SOD活性升高,高温处理的时间越长,转基因烟草幼苗叶片SOD活性越高,而非转基因烟草幼苗叶片SOD活性没有明显变化(图5)。由于SOD是一种有效的抗氧化酶,因此,SOD活性的增加可增强植物的逆境耐性。由此认为,转基因烟草幼苗比非转基因烟草更能适应生理高温环境。3生理高温对烟草幼苗抗氧化酶系统的影响植物在逆境下,通过代谢反应来阻止、降低或修复由逆境造成的损伤,从而保持正常的生理活动。在植物可忍耐的范围内,逆境所造成的伤害是可逆的,即植物可以恢复正常状态;如果超过可忍耐的范围,超出植物自身修复能力,损伤将变成不可逆的,植物将受害甚至死亡。生理高温对植物造成的伤害是可逆的。在生理高温胁迫下,植物的呼吸速率增大,消耗的有机物增多,积累的物质减少,植物生长缓慢,单株重减轻。耐热性强的植物则受影响较小。在生理高温胁迫下,植物细胞内的可溶性糖含量增加,为呼吸速率的提高提供物质和能量条件。植物细胞内的可溶性糖含量越高,细胞的呼吸代谢越旺盛。呼吸代谢产生的对细胞有害中间产物(如O-2,OH-等活性氧类)增加,这些产物的积累会损伤细胞,甚至使细胞死亡。活性氧类伤害植物细胞的重要证据之一,是它们使细胞膜脂过氧化。MDA是植物细胞膜脂过氧化的终产物,其含量越高说明植物细胞受到的伤害越大。与耐热性弱的植物相比,在生理高温胁迫下,耐热性强的植物细胞MDA含量较低。植物细胞膜脂过氧化的结果是细胞膜的通透性增大,细胞外渗的物质增加,对细胞的正常生活造成伤害。耐热性强的植物在生理高温下,细胞受到的伤害较小,细胞膜的透性较低。在生理高温胁迫下,细胞内的SOD(一种重要的抗氧化酶)能够专一清除细胞有氧代谢产生的过多的活性氧类(O-2),减轻或避免活性氧类对植物细胞的伤害。在生理高温胁迫下,耐热性强的植物细胞内的SOD活性更高。本试验发现,转基因烟草幼苗受生理高温处理时,其SOD活性明显升高,MDA和可溶性糖含量升高较小。生理高温对供试烟苗品系细胞质膜的伤害可能是一种渐变的量变过程。经生理高温处理3d和6d,烟苗细胞质膜均未明显表现受伤害现象。在恢复生长期间,生理高温处理后的烟苗细胞质膜才表现出受害症状。与非转基因烟草相比,转基因烟草幼苗细胞质膜