三叶青提取物抗炎镇痛及热板法的研究

三叶青提取物抗炎镇痛及热板法的研究

三叶青是葡萄科植物的黄叶崖藤（gilg）干燥的分段根，分布在我国浙江、江西、福建、台湾、湖北、广东、四川、贵州、云南等省区。具有清热解毒、散粘液、循环止痛的功效，临床治疗高烧、腹痛、肺炎、哮喘、肝炎等疾病，但未发现现代药理治疗。本实验对三叶青提取物在抗炎、镇痛及解热等方面进行了药理学实验研究,为其临床应用提供了实验依据。材料和方法1材料表面1.1制备含生药产品三叶青干品,购于浙江省中医院中药房,经浙江中医学院资源鉴定教研室鉴定。三叶青提取物(ExtractofRadixTetrastigmae,ERT)的制备:将1000g药材常规加工粉碎后过20目筛,用水回流提取2次,用旋转蒸发仪浓缩至相当于含生药0.16g·mL-1,置冰箱备用。伊文思兰(进口分装,国药集团化学试剂有限公司,批号F20040213);二甲苯(分析纯,江苏三木集团化工厂产品,批号20000410);醋酸(分析纯,浙江杭州化学试剂有限公司,批号20040607);阿司匹林肠溶片(南京白敬宇制药有限责任公司,批号:040622);罗通定片(广东省博罗先峰药业集团有限公司,批号:030601);干酵母(浙江省富阳市杭富生物制品厂,批号:050121);2,4-二硝基苯酚(上海试剂三厂,批号950920)。1.2动物昆明种小鼠,18~22g,雌雄兼用;SD大鼠180~200g,雌雄兼用。均由浙江中医学院实验动物中心提供。1.3鼠部水质及体温w721型分光光度计(四川分析仪器厂产品);GJ-8402型热板测痛仪[电压220V,功率150W,温度(55±0.2)℃,浙江宁海白石电子医药仪器厂产品];RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);半导体体温表(上海医用仪表厂);TG-328型电子分析天平(上海天平仪器厂);排水法测定鼠爪体积装置(自制);TDZ5-WS低速自动平衡离心机(湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司)。2方法2.1抗炎作用2.1.1小鼠分组及给药方案取小鼠50只,雌雄各半,随机均分5组。空白对照组给同剂量的生理氯化钠溶液(NS),ERT高中低剂量3组(4.8,2.4,1.2g·kg-1)、阳性药组(阿司匹林100mg·kg-1)。各组均ig给药,qd,连续4d。于末次给药后1h,每组每只小鼠依次自尾静脉注射5%伊文思兰0.1mL·10g-1,同时腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2mL。30min后断头处死小鼠,剖开腹腔,每次用5mL生理氯化钠溶液冲洗腹腔,共3次,用吸管吸取腹腔洗出液,离心5min(3000r·min-1),取上清液,721型分光光度计590nm测吸收度。2.1.2ld503d取小鼠50只,雌雄各半,随机均分5组,分组情况同2.1.1。各组均ig给药,qd,连续4d。于末次给药后1h,各组小鼠右耳廓两面均匀涂抹二甲苯(每只0.05mL),4h后脱颈椎处死小鼠,沿耳廓边缘剪下左、右两耳,用8mm打孔器在两耳相同部位取下耳片,电子分析天平称重,用右耳片重量减去左耳片重量,即得到肿胀净值,并计算耳肿抑制率。2.1.3大鼠sc10%蛋清取雌雄大鼠50只,随机均分5组,分组情况同2.1.1。各组均ig给药,qd,连续4d。于实验当日先用排水法测定鼠爪体积装置测量每只大鼠右后足跖正常体积,给药后60min,予每只大鼠右后足跖(右后足掌心向踝关节方向)sc10%蛋清0.1mL。分别测量给药后1,2,3及4h大鼠右后足跖体积,用致炎后体积减去正常体积所得差值,即为各时间段足跖肿胀净值。2.2使用植物镇痛2.2.1阳性组和阳性药组10.2.4取雌雄各半小鼠50只,随机均分5组。分别为空白对照组(NS)、ERT高中低剂量3组(4.8,2.4,1.2g·kg-1)、阳性药组(罗通定50mg·kg-1)。各组均ig给药,qd,连续3d。于末次给药后1h,各组小鼠均ip0.6%醋酸溶液0.2mL,记录自注射醋酸致痛后每只小鼠在20min内出现的扭体反应次数,结果作组间比较,并计算镇痛率。2.2.2给药前痛阈值的测定取雌性小鼠若干,于正式实验前先逐只用热板测痛仪进行筛选。筛选时每次取小鼠1只,记录自放入测痛仪中至出现舔后足所需时间(s),以此作为该小鼠给药前痛阈值,凡是5s内出现舔后足或30s内不出现舔后足者弃之不用。将预选合格的小鼠作正式实验,每组10只,共5组,分组情况同2.2.1。各组均ig给药,于给药后每隔30min测定各组小鼠痛阈值,连续测3次。超过60s者则按60s计算。2.3set的解热作用2.3.1大鼠前近代血清学指标检测大鼠前因子检测取雌雄大鼠若干,预测体温3d,bid。实验当日测定大鼠基础体温,筛选体温波动小者为实验用大鼠,用20%酵母混悬10mg·kg-1注入大鼠背部皮下,6h后测量肛温,凡直肠温度上升不到0.8℃的大鼠剔除不用,取合格大鼠50只分为5组,空白对照组(NS)、ERT3组(4.8,2.4,1.2g·kg-1)、阳性药组(阿司匹林100mg·kg-1),均ig给药,于给药后每隔60min测定各组大鼠肛温,连续测3次。2.3.2实验用大鼠分组取雌雄大鼠50只,预测体温3d,bid。实验当日测定大鼠基础体温,筛选体温波动小者为实验用大鼠。随机均分5组,分组情况同2.3.1,均ig给药。灌胃给药后60min,于背部皮下注射2,4-二硝基苯酚10mL·kg-1(160mg·kg-1)致热,每隔30min测量大鼠体温1次,连续测定3h。3实验数据处理镇痛、抗炎及解热各实验结果数据均采用ˉx±s表示。结果统计均采用SPSS10.0统计软件进行。结果1影响小鼠和大鼠的急性炎症反应1.1细血管透皮张力结果表明,ERT高、中剂量组对小鼠毛细血管通透性有显著的抑制作用,见表1。与对照组比较,a:P<0.05,b:P<0.01,c:P<0.001(下同)1.2耳廓急性炎症性水肿结果表明,ERT各剂量组可明显抑制二甲苯所致小鼠耳廓急性炎症性水肿,与空白对照组比较差异显著。提示ERT对二甲苯所致小鼠耳肿胀有明显抑制作用,见表2。1.3ert的抑制作用结果表明,在蛋清致大鼠足跖致炎4h的不同时间段内,ERT各剂量组均有抑制肿胀作用,与空白对照组比较差异显著,提示ERT对蛋清致大鼠足肿胀有显著抑制作用,见表3。2影响小鼠疼痛反应的因素2.1致小鼠扭体次数与空白对照对结果表明,ERT高、中剂量组对醋酸所致小鼠扭体次数与空白对照组比较明显减少,具有显著差异。提示药物对醋酸所致小鼠扭体反应有明显抑制作用,见表4。2.2影响热板反应的因素结果表明,ERT各剂量组均能提高热致痛小鼠的痛阈率,提示其可抵抗热致痛对小鼠的影响,并使其痛感潜伏期明显延长,见表5。3解热作用3.1两组大鼠体温下降持续时间比较结果表明,ERT高、中剂量组能使酵母致热的大鼠体温下降持续时间达180min;而低剂量组只有在180min时才体现降温作用。提示ERT对干酵母所致大鼠高热有解热作用,见表6。3.2两组体温下降ERT高、中剂量组能使2,4-二硝基苯酚致热的大鼠体温下降,持续时间达180min之久;而低剂量组于150min后才体现明显的降温作用。提示ERT对2,4-二硝基苯酚所致大鼠高热有解热作用,见表7。热板法小鼠炎症因子各组ERT能明显抑制醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性,其中以4.8g·kg-1作用最明显(P<0.001);对二甲苯所致小鼠耳壳肿胀有明显的抑制作用,与阿司匹林作用相似(P<0.001);ERT还可抑制大鼠蛋清性足肿胀,尤其在2.4g·kg-1作用显著(P<0.001),优于阿司匹林。结果提示ERT对急性炎症有明显的抑制作用。ERT各组对醋酸所致小鼠扭体次数较空白对照组明显减少,其中2.4g·kg-1作用最明显(P<0.001);同时ERT各组还能显著提高热板法小鼠痛阈值,提示ERT有明显的镇痛作用。ERT各组能显著降低干酵母