菌根烟苗移栽对青枯病的危害

菌根烟苗移栽对青枯病的危害

草场腐败（f.smith.）是一种典型的保护性疾病，可能会导致根、茎和叶的损伤。青枯病在我国长江以南烟区普遍发生,烟田发病率可达到30%~100%,严重威胁烤烟的产量和品质。研究表明,接种AM真菌能抑制病原微生物,提高作物抗病能力,包括大豆胞囊线虫病,辣椒黄萎病,番茄黄萎病,马铃薯青枯病及番茄青枯病等。但另一些研究则表明,接种AM真菌不能减轻植物病害,甚至加重病害的发病程度。此外,不同AM真菌的抗病性效应不同,AM真菌在作物不同品种上的效应也不一样。所以,菌根烟苗移栽后能否提高烤烟抗青枯病能力尚待证实。试验通过盆栽和病区大田试验,比较了菌根和非菌根烟苗移栽后的青枯病发病率、病情指数,以及接种青枯菌后烤烟根系几丁质酶活性变化。目的是弄清菌根烟苗是否具有抗青枯病的作用,并初步探索其抗病机理。1材料和方法1.1试验材料1.1.1养养液的配制供试烤烟品种为K326(NicotianatabacumL.),由贵州省烟草公司遵义市公司提供。菌根烟苗:在漂浮育苗条件下,播种期接种根内球囊霉(GlomusintraradicesSmith&Schenck,BEG-141,简称G.i)和摩西球囊霉(GlomusemosseaeGerdemann&Trappe,BEG-167,简称G.m),培养液养分用量为0.8×Hoagland,由低到高,分次供应。成苗期镜检接种G.i烟苗侵染率≥20%,接种G.m烟苗侵染率≥10%。非菌根烟苗:在漂浮育苗条件下,播种期接种等量灭活接种物,培养液养分用量为1.2×Hoagland,提供方式同菌根烟苗的培育,成苗期镜检未发现菌根结构。1.1.2西南大学r.s植物生物学学院开发学院青枯菌(RalstoniasolanacearumE.F.Smith,简称R.s),由西南大学植物保护学院提供。首先用强毒力菌株选择培养基(TTC)选择具有活性的烟草青枯菌,然后转接到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上培养2~3d后,按照麦法兰浑浊计数法制备烟草青枯菌孢子悬浮液,浓度为109cfu/mL,备用。1.1.3土壤有机质性质盆栽试验的供试土壤采自贵州省遵义烟草分公司湄潭科技园,为灰岩黄壤,pH7.1,有机质2.64%,全磷0.99g·kg-1,碱解氮79.98mg·kg-1,速效磷3.02mg·kg-1,速效钾98.94mg·kg-1。风干土壤,拣去杂物,过筛,高温灭菌(121℃,2h)后备用。田间试验的土壤理化性质同上。1.2非菌根烟苗+青枯菌nm+r.s盆栽试验:盆栽试验的处理包括4个处理(1)G.i菌根烟苗+青枯菌(G.i+R.s);(2)G.m菌根烟苗+青枯菌(G.m+R.s);(3)非菌根烟苗+青枯菌(NM+R.s);(4)非菌根烟苗(CK)。每处理种植24盆,每盆1株,共96盆。盆栽试验在西南大学人工控制温、光、湿的培养室中进行。田间试验:位于贵州省遵义烟草分公司湄潭科技园,烤烟青枯病长年发生。处理包括:(1)G.i菌根烟苗(G.i);(2)G.m菌根烟苗(G.m);(3)非菌根烟苗(CK)。小区总面积330m2,株行距=0.4m×1.3m,每处理种烟6行,每行35株,四周设保护行。1.3青枯菌的引进盆栽试验:移栽前,镜检确认供试的菌根或非菌根烟苗,选择均匀一致的烟苗种植于盆钵(口径22cm,底径17cm,高16cm)中,每盆装土2kg。种植前用0.2%高锰酸钾消毒盆钵,无菌水冲洗,阴干。移栽时,按照大田生产方法移栽烟苗。将菌根烟苗整体从育苗盘中取出,连同根上基质一起埋入盆中。移栽15d后,按照以下方法接种青枯菌:先用小铲疏松烟株基部的土壤,沿烟株的茎浇灌青枯菌液10mL,再用注射器从顶芽下第3叶叶脉向下注射菌液3mL。移栽后适时浇水,每周喷300mLHoagland营养液1次。试验期间的光照强度20000~15000lx,每日光照13h,温度控制在25℃(夜)~33℃(昼),相对湿度75%~85%。田间试验:田间试验的各项管理同当地烤烟栽培管理一致。1.4测量设计和方法1.4.1烟株组次发病分级接种青枯菌的盆栽试验每隔5d调查1次,共8次。田间试验在烤烟上部叶片采摘完毕后调查。病情分级标准参照方树民等的方法:0级:烟株无病,I级:烟株基部少数叶片发病,轻度凋萎或基部偶有褪绿条斑,II级:烟株中下部多数叶片发病凋萎或茎基部有明显的黑色条斑;III级:烟株2/3以上叶片发病凋萎或茎基部黑色条斑扩展到顶部,IV级:全株凋萎或死亡。分别以下式计算病情指数、发病率和防治效果:病情指数=∑(级数×该级数发病株数)/(总调查株数×最高级数)发病率%=发病株数/调查株数×100防治效果%=(非菌根烟苗的病情指数-菌根烟苗的病情指数)/非菌根烟苗的病情指数×1001.4.2根系侵蚀率测定盆栽试验:接种青枯菌后第40d(移栽后55d),将各处理根系取出,洗净,切成1cm根段,经0.01%酸性品红乳酸甘油染色液染色后,按照根段频率标准法测定根系侵染率。田间试验:根系采样在移栽后70d进行,根系侵染率测定同上。1.4.3几丁质酶活性测定,当n-乙酰氨基葡萄糖比色法测定在接种青枯菌盆栽试验中,分别于接种后第0d,1d,2d,3d,4d,5d,6d,用灭菌打孔器从烟株基部取出根系,用N-乙酰氨基葡萄糖比色法测定几丁质酶活性。2结果与分析2.1田间病员对菌株病理变化的检测在接种青枯菌的盆栽试验中,烟苗均出现不同程度的感病症状,未接者未出现病症,说明青枯菌是有效的。图1和图2可知,接种青枯菌后,各处理的病情指数和发病率的变化规律基本相同。菌根烟苗显著提高了对青枯病的抗性。接种青枯菌后第5d,非菌根苗出现了少数病株,而菌根苗未出现任何感病症状,说明菌根烟苗可以延迟青枯病的发生。接种青枯菌后第20d~40d,非菌根苗的病情指数和发病率显著高于G.m菌根苗;第30d~40d,非菌根苗的病情指数和发病率显著高于菌根苗。这说明菌根烟苗显著降低了青枯菌对植株的危害程度。烟苗移栽后,随着茎部的生长并逐渐木质化,各处理烟苗抗青枯病能力也逐渐加强。第30d后,两种菌根苗的病情指数和发病率,非菌根苗的病情指数都有下降趋势,但非菌根苗的发病率没有显著变化。这说明随着植株生长,AM真菌的菌根效应逐渐发挥,增强了植株的抗病能力。田间试验的病情调查可见(表1),供试地块的青枯病发生十分严重,非菌根苗接近全部出现青枯病症。菌根苗显著降低了病情指数和发病率,其中每行植株中有3~6株未发生青枯病。2.2菌根烟苗移栽对am真菌初始渗透率的影响在盆栽试验中,菌根苗AM真菌侵染率的变化规律相似(表2)。移栽前,菌根烟苗的菌根结构主要以丛枝和根内菌丝为主,少见泡囊和孢子;移栽后55~70d,烤烟根系AM真菌的侵染率显著增加,接种G.i的菌根烟苗的根内泡囊、根外菌丝和接种G.m的菌根烟苗的根外孢子、根外菌丝均大量增加。说明菌根烟苗移栽后,菌根结构发育良好,AM真菌侵染率继续上升。在田间试验中,对照烤烟根系也有少量的侵染,推测是土著AM真菌感染,但侵染率显著低于菌根烟苗,故菌根烟苗具有青枯病抗性较高应该是AM真菌的菌根效应。2.3苗几丁质酶活性图3可知,接种青枯菌前,菌根烟苗几丁质酶活性显著高于非菌根烟苗;接种青枯菌后,菌根苗的几丁质酶活性均显著高于非菌根苗。菌根苗几丁质酶活性先升高,后略降。这说明接种青枯菌后,启动了烤烟根系防御性反应,导致几丁质酶合成增加。必须指出的是,菌根烟苗几丁质酶活性上升的时间显著早于非菌根烟苗。接种青枯菌后,G.i和G.m菌根烟苗几丁质酶活性迅速增加,接种后第2d即达到高峰;而非菌根苗达到最高值的时间在接种后第4d,比菌根烟苗晚2~3d。这说明菌根烟苗根系在受到病菌侵染时能快速产生防御性反应。3菌根烟苗和几丁质酶接种青枯菌的盆栽试验和大田病区试验烟表明,植株均出现不同程度的感病症状。菌根烟苗发病时间比非菌根苗晚5d左右,且发病率和病情指数低于非菌根烤烟。在大田试验中,还出现菌根烟苗不感病的植株,而非菌根烟苗发病率接近100%。说明接种AM真菌可以提高烤烟抗青枯病的能力。试验还表明,移栽菌根烟苗后,AM真菌可在根系中进一步发育,侵染率继续升高。Vigo等认为,AM真菌可能是与病原菌争夺侵染位点,减少了病原菌的侵染部位和感染概率。所以,我们认为,菌根烟苗的发病率低的原因之一可能是AM真菌与青枯菌争夺烤烟根系上的侵染位点,减少青枯菌的侵入空间和感染概率。几丁质酶普遍存在于高等